鹽礦嗜鹽古菌多樣性及其產胞外蛋白酶初步研究.pdf

1、鹽礦是一類極端高鹽環(huán)境，蘊藏著豐富多樣的嗜鹽古菌類群，是開展嗜鹽古菌理論與應用研究的珍貴資源。云南鹽礦作為我國重要的陸地高鹽環(huán)境，特殊的地質構造形成了鹽礦集中分布的特性，一平浪鹽礦就是其中規(guī)模較大的鹽礦之一。本文從云南一平浪鹽礦采集樣品，培養(yǎng)、分離、純化嗜鹽古菌測定嗜鹽古菌菌株的16S rRNA基因序列，揭示可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性；對部分疑似新物種的菌株，進行多相分類學研究以確定它們的分類地位；篩選出產胞外蛋白酶能力較強的菌株，對其所產粗

2、酶的酶學特性進行初步研究。
　　基于16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明：云南一平浪鹽礦的59株嗜鹽古菌分屬14個屬的20個分類單元，其優(yōu)勢類群為Natronococcus類群、Natrinema類群和Halococcus類群。多相分類學研究表明，菌株YPL13代表一個新種，菌株YPL18代表一個新屬。
　　篩選云南一平浪鹽礦分離的59株嗜鹽古菌，得到12株產胞外蛋白酶菌株，其中YPL20、YPL23、YPL2

3、4、YPL26產胞外蛋白酶水平最高，對其進行16S rRNA基因和rpoB′基因序列分析，結果表明均為Halococcus salifodinae菌株，其中YPL20和YPL23為相同菌株，YPL24和YPL26為相同菌株。因此，選擇H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26作為進一步研究對象。嗜鹽古菌胞外蛋白酶的表達與培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富情況尚未有過報道，本實驗使用分別添加牛奶或明膠的營養(yǎng)缺乏的NOM

4、、營養(yǎng)適中的HM、營養(yǎng)豐富的CM平板培養(yǎng)基培養(yǎng)H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株并觀察胞外蛋白酶產生水平，結果表明H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株胞外蛋白酶的產生受寡營養(yǎng)條件的誘導，在 NOM培養(yǎng)基中產胞外蛋白酶水平最高。使用 NOM培養(yǎng)基培養(yǎng)H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株并制

5、備粗酶液進行酶學性質表征，結果表明H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26分泌的胞外蛋白酶具有耐高溫耐鹽堿以及良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的特征，Mn2+對蛋白酶的酶活性表現(xiàn)出顯著的激活作用，而 Cu2+、Zn2+能夠抑制蛋白酶的活性。H. salifodinae YPL20的胞外蛋白酶最適反應溫度為50℃，最適反應pH為9.0，最適 NaCl濃度為0 M；H. salifodinae YPL26

6、的胞外蛋白酶最適反應溫度為75℃，最適反應pH為8.0-9.0，最適NaCl濃度為2.5 M。有趣的是，對氯汞苯甲酸PCMB和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF均能夠抑制H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26的胞外蛋白酶活性，暗示著 H. salifodinae YPL20和 H. salifodinae YPL26的胞外蛋白酶粗酶液中可能存在著活性位點為半胱氨酸和絲氨酸的蛋白酶。因此，在未來的研究中