基于植物酯酶與有機(jī)磷水解酶的農(nóng)藥殘留電化學(xué)傳感器研究.pdf

1、在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥的廣泛使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著不可替代的重要作用，因其有效的提高了農(nóng)作物產(chǎn)量，從而帶來(lái)了巨大的農(nóng)業(yè)收益。隨著農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境的污染和人類健康的威脅也逐漸引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。有機(jī)磷農(nóng)藥作為使用最廣泛、毒性最強(qiáng)的農(nóng)藥種類，能不可逆地抑制膽堿酯酶活性，使得乙酰膽堿在神經(jīng)突觸上大量積累，從而干擾神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)，甚至導(dǎo)致動(dòng)物體死亡[1-3]。目前主要的農(nóng)藥檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的大型儀器檢測(cè)法，雖然具有高靈敏度和高精確

2、性等優(yōu)點(diǎn)，但由于其儀器設(shè)備昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)、需專業(yè)人員操作等難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年來(lái)，電化學(xué)生物傳感器因其操作步驟簡(jiǎn)單、成本較低且能實(shí)現(xiàn)快速原位檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)。
　　本研究基于植物酯酶（抑制型）/有機(jī)磷水解酶（催化型）復(fù)合納米材料構(gòu)建了兩種酶型電化學(xué)生物傳感器，采用UV-vis、SEM、TEM、FTIR、XRD、Raman和EDX等手段對(duì)所制備的復(fù)合材料形貌及晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。通過(guò)循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、電化學(xué)

3、交流阻抗法和計(jì)時(shí)電流法等對(duì)所構(gòu)建傳感器的電化學(xué)行為和作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，開展的研究工作如下：
　　(1)通過(guò)兩步雙水相萃取法[4]提取純化得到植物酯酶（PLaE）純品，SDS-PAGE結(jié)果顯示其純度較高；采用硼氫化鈉還原法制備得到穩(wěn)定的金納米顆粒（AuNPs），并通過(guò)與石墨烯（GNs）進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理混合制備得到了導(dǎo)電性好和具有大比表面積的復(fù)合材料AuNPs-GNs，PLaE通過(guò)與生物相容性好的

4、殼聚糖（CS）復(fù)合固定到已滴加AuNPs-GNs復(fù)合物的玻碳電極（GCE）表面。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，所制備的NF/PLaE-CS/AuNPs-GNs/GCE生物傳感器成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲基對(duì)硫磷和馬拉硫磷分別從0.05 ppb至200 ppb（0.19 nM~760 nM）和從0.5 ppb至500 ppb（1.51 nM~1513.5 nM）寬的動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)，農(nóng)藥濃度與電流抑制率顯示較好的相關(guān)性，其檢測(cè)限低至50 ppt（0.19 nM）

5、和0.5 ppb（1.51 nM）（S/N=3）。干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NF/PLaE-CS/AuNPs-GNs/GCE對(duì)樣本中常見的干擾物物種如金屬離子、無(wú)機(jī)鹽離子、葡萄糖和檸檬酸等具有較強(qiáng)的抗氧化能力。最后，在實(shí)際樣本（胡蘿卜和蘋果）良好的加標(biāo)回收率，意味著PLaE-CS/AuNPs-GNs復(fù)合材料應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)的可行性。相比同類抑制型的乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅?，植物酯酶?lái)源廣、價(jià)格低廉且操作步驟簡(jiǎn)單，在發(fā)展酶型農(nóng)藥殘留傳感器有巨大的潛在應(yīng)

6、用價(jià)值。
　　(2)高度純化的類彈性蛋白多肽-有機(jī)磷水解酶（ELP-OPH）從大腸桿菌的基因工程菌中提取并利用類彈性蛋白多肽（ELPs）的獨(dú)特溫控可逆相變過(guò)程對(duì)ELP-OPH進(jìn)行分離純化[5]，通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證了其純化效果。采用高溫煅燒靜電紡絲法制備二氧化鈦納米纖維（TiO2NFs），其表面具有強(qiáng)親和力的磷酸基團(tuán)可用來(lái)吸附豐富有機(jī)磷化合物。TiO2NFs與金納米顆粒（AuNPs）進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理混合得到TiO2NFs-AuN

7、Ps復(fù)合材料并修飾于電極表面，牛血清蛋白（BSA）用于增強(qiáng)ELP-OPH的穩(wěn)定性固定在已修飾電極表面。對(duì)其實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，ELP-OPH/BSA/TiO2NFs/AuNPs/GCE傳感器通過(guò)計(jì)時(shí)電流法對(duì)MP實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)（<5s），其檢測(cè)的線性范圍可達(dá)46.4μM（R2=0.9934），檢測(cè)靈敏度為926μA cm?2 mM?1，檢測(cè)限低至26 nM。與抑制型的酶型傳感器相比較，該NF/ELP-OPH/BSA/TiO2N

8、Fs/AuNPs/GCE催化型的酶型傳感器展現(xiàn)出了檢測(cè)時(shí)間短、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。
　　(3)構(gòu)建了ELP-OPH/BSA/TiO2NFs/c-MWCNTs/GCE傳感器并用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)。羧酸功能化的多壁碳納米管（c-MWCNTs）相比于AuNPs，不僅在檢測(cè)時(shí)能提高電子轉(zhuǎn)移速率，更能夠通過(guò)活化的-COOH共價(jià)固定更多ELP-OPH以提高傳感器電化學(xué)檢測(cè)性能。將TiO2NFs/c-MWCNTs復(fù)合物滴加到玻碳電極表面，通過(guò)N-羥基

9、琥珀酰亞胺（NHS）和1-乙基-3-（3二二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）混合物對(duì)c-MWCNTs上的-COOH進(jìn)行活化，使得ELP-OPH能更多更加穩(wěn)定的固定到電極上。ELP-OPH/BSA/TiO2NFs/c-MWCNTs/GCE對(duì)甲基對(duì)硫磷和對(duì)硫磷均表現(xiàn)出快速的檢測(cè)響應(yīng)（<5s）和寬泛的線性范圍，檢測(cè)限（S/N=3）低至12 nM（甲基對(duì)硫磷）和10 nM（對(duì)硫磷）。其優(yōu)良的電化學(xué)傳感性能可以歸因于TiO2NFs-MWCN