Tim--3對高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞遷移的影響.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化是2型糖尿病大血管病變的病理基礎，而啟動動脈粥樣硬化早期改變的就是血管內(nèi)皮功能異常，內(nèi)皮功能異常的表現(xiàn)之一就是遷移功能的變化。T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域因子3(T cell immunoglobulin and mucmdomain containing molecule3，Tim3)是表達于內(nèi)皮細胞的一種糖蛋白，與內(nèi)皮細胞移動變化的相關性目前未見報道。本研究目的就是確定Tim3蛋白在不同葡萄糖濃度下是

2、否對內(nèi)皮細胞遷移功能產(chǎn)生影響。
　　方法:
　　以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為研究對象，應用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，阻斷內(nèi)皮細胞Tim3蛋白表達，并在不同葡萄糖濃度下對細胞進行培養(yǎng)。在本研究中，實驗分為三大組:正常對照組，si-Tim3干擾組，si-Tim3無效干擾組。三組細胞分別在正常培養(yǎng)基及賦糖培養(yǎng)基（5.5mmol/L葡萄糖或60mmol/L葡萄糖）中培養(yǎng)24h、48h、72h

3、。顯微鏡下觀察各組細胞不同時間點細胞形態(tài)及細胞遷移變化。應用劃痕及Transwell實驗評估細胞遷移功能的變化，并計算培養(yǎng)72h細胞的細胞遷移率和遷移數(shù)量。同時收集培養(yǎng)72h細胞，通過Real-time PCR、Western blot分別檢測Tim3及與細胞遷移能力相關的標志蛋白（E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1）的mRNA與蛋白表達水平，并分別應用2-△△CT方法和凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro

4、-Analyzer軟件)對其進行半定量分析。
　　結果:
　　1.細胞形態(tài)
　　正常培養(yǎng)下，正常列照組及Tim3無效干擾組細胞排列整齊，形態(tài)正常;而Tim3干擾組細胞則排列紊亂、不規(guī)則細胞比例增多。賦糖培養(yǎng)下，當糖濃度為5.5mmol/L時，各組細胞形態(tài)與在正常培養(yǎng)下的各對應細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時，正常細胞組的細胞形態(tài)也出現(xiàn)異常，Tim3干擾組細胞排列紊亂進一步加重。
　　2.細胞遷移變化

5、>　　2.1 劃痕實驗:正常培養(yǎng)下，正常對照組遷移率為82.85±3.75％，無效干擾組細胞遷移率為82.57±2.15％，Tim3干擾組細胞遷移率為60.37±7.86％，與正常對照組相比明顯降低(P＜0.05)。賦糖培養(yǎng)下，在糖濃度為5.5mmol/L時，正常細胞組、Tim3無效干擾組、Tim3干擾組細胞遷移率分別為82.34±3.52％、79.13±4.91％、65.13±4.08％，與正常培養(yǎng)下的各對應細胞組一致;在糖濃度為60

6、mmol/L時，上述三組細胞遷移率分別為61.36±7.42％、61.24±7.17％、3558±5.25％，Tim3干擾組細胞遷移率顯著低于正常細胞組(P＜0.05)，此條件下培養(yǎng)的三組細胞遷移率均明顯低于正常培養(yǎng)下各對應細胞組的細胞遷移率。
　　2.2 Transwell實驗:通過遷移細胞數(shù)量來反應細胞移動能力。正常培養(yǎng)下，正常對照組遷移細胞數(shù)為144±16個，Tim3干擾組遷移細胞數(shù)為53±7個，兩組相比差異顯著(P＜0.0

7、5)。Tim3無效干擾組遷移細胞數(shù)與正常對照組接近，為148±16個。賦糖培養(yǎng)下，在糖濃度為5.5mmol/L時，正常細胞組、Tim3無效干擾組、Tim3干擾組遷移細胞數(shù)分別為127±14、134±20、52±8個，與正常培養(yǎng)下的各組情況相似;在糖濃度為60mmol/L時，正常細胞組遷移細胞數(shù)為56±8個，Tim3無效干擾組遷移細胞數(shù)為52±5個，Tim3干擾組遷移細胞數(shù)為19±4個，較正常細胞組顯著減少(P＜0.05);此條件培養(yǎng)下的

8、三組細胞遷移數(shù)均明顯低于正常培養(yǎng)下各對應細胞組的細胞遷移數(shù)。
　　3.移動標志相關蛋白的mRNA表達水平變化
　　本研究檢測了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下，正常對照組E-cadherin、α-catenm mRNA表達水平分別為1.00±0.06和1.00±005，Vimentin和ZEB1mRNA表達水平分別為1.00±0.05和1.00±0.10。Tim3

9、無效干擾組上述各蛋白mRNA表達水平分別為1.13±0.07、0.93±006、0.98±005和092±0.07。Tim3干擾組各蛋白的mRNA表達水平則分別為278±0.29、3.35±0.14、0.44±0.02、0.67±0.02，與正常對照組相比，E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平顯著增高，而Vimentin和ZEBl mRNA表達水平顯著下降（P＜0.05）;進行賦糖培養(yǎng)，糖濃度為5.5mmol/L時

10、，各蛋白mRNA表達水平與正常培養(yǎng)下各對應細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時，正常細胞組E-cadherin和α-catenin mRNA表達水平分別為3.25±0.11和4.23±0.33，Vimentin和ZEBl mRNA表達水平分別為0.37±0.03和0.49±0.03。無效干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平分別為3.12±0.24和3.96±0.13，Vimentin和ZEB1mRNA表達

11、水平分別為0.36±0.02和0.49±0.04，與正常細胞組相比無明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平分別為4.25±0.29和5.34±012，Vimentin和ZEB1mRNA表達水平分別為0.22±0.01和0.18±0.01，與正常細胞組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述四種蛋白mRNA表達水平與正常培養(yǎng)下各對應細胞組相比，E-cadherin和α-catenin明顯增高，

12、Vimentin和ZEB1明顯下降，在Tim3干擾組表現(xiàn)更為明顯，組間比較均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.移動標志相關蛋白水平變化
　　本研究檢測了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下，正常對照組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為1.00±0.07和1.00±0.13，Vimentin和ZEB1蛋白表達水平分別為1.00±0.07和

13、1.00±0.05。Tim3無效干擾組上述各蛋白表達水平分別為0.97±0.11、1.13±0.13、1.06±0.09和0.93±0.09。Tim3干擾組各蛋白的表達水平則分別為2.43±0.24、3.72±0.33、0.35±0.05和0.41±0.03，與正常對照組相比，E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平顯著增高，而Vimentin和ZEB1表達水平顯著下降（P＜0.05）;進行賦糖培養(yǎng)，在糖濃度為5.5mmol

14、/L時，各蛋白表達水平與正常培養(yǎng)下各對應細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時，正常細胞組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為2.34±0.11和3.65±0.23，Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.37±0.04和0.40±0.04。無效干擾組E-cadhern、α-catenin蛋白表達水平分別為2.38±0.14和3.68±0.24，Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.36±0.07和0.

15、36±0.04，與正常細胞組相比無明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為4.67±0.36和6.20±0.42，Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.24±0.03和0.12±0.02，與正常細胞組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。上述四種蛋白表達水平與正常培養(yǎng)下各對應細胞組相比，E-cadherin、α-catenin明顯增高，而Vinentin和ZEB1明顯下降，在Tim3干擾組