納豆芽孢桿菌脲酶酶學(xué)特性研究和ure缺失載體構(gòu)建.pdf

1、納豆是日本傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵而得，具有多種營養(yǎng)保健功能。但在納豆發(fā)酵的過程中納豆芽孢桿菌代謝生成氨，使納豆有刺激性氣味。研究表明引起納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)氨的主要是氨基酸脫羧酶催化的轉(zhuǎn)氨作用、谷氨酸脫氫酶（GDH）催化的聯(lián)合脫氨基作用及脲酶催化的尿素降解作用。脲酶是納豆芽孢桿菌氮代謝途徑中很重要的一種胞內(nèi)酶，可催化尿素水解生成二氧化碳和氨，而有關(guān)枯草芽孢桿菌中脲酶對代謝影

2、響研究較少。
　　本研究首先研究納豆芽孢桿菌脲酶的酶學(xué)性質(zhì)，探索是否可以通過控制發(fā)酵條件，生產(chǎn)低氨味納豆。同時(shí)，得到酶活研究的最適產(chǎn)酶條件。本文研究了不同的碳源、氮源及不同的培養(yǎng)條件下納豆芽孢桿菌（CGMCC No.2801）的脲酶產(chǎn)量及溫度、pH和金屬離子對脲酶活性的影響。結(jié)果表明以谷氨酸為氮源，蔗糖為碳源，pH7，37℃條件下培養(yǎng)12 h時(shí)脲酶的產(chǎn)量最高，為57.2μg/mL。脲酶的最適反應(yīng)條件為35℃、pH7，所選的幾種金屬

3、離子對脲酶活性均有抑制作用，抑制強(qiáng)度為Cu2+>Zn2+>Fe2+>Mg2+>Mn2+，最大抑制率為36.4％。
　　納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆的條件與產(chǎn)脲酶最適條件基本一致，難以通過調(diào)節(jié)發(fā)酵條件調(diào)控脲酶的產(chǎn)量。本文按照同源重組雙交換方案構(gòu)建了納豆芽孢桿菌脲酶缺失突變的重組載體，以期構(gòu)建脲酶編碼基因(ure)缺失的低產(chǎn)氨納豆芽孢桿菌工程菌，從而在保證其發(fā)酵品質(zhì)的同時(shí)降低氨產(chǎn)量。根據(jù)對納豆芽孢桿菌ure基因及其上下游序列的分析，設(shè)計(jì)引

4、物，PCR擴(kuò)增得到ure上下游同源臂ure12和ure34，并在同源臂中引入HindIII、Xhol、BamHI和SalI/BamHI酶切位點(diǎn)，測序結(jié)果表明序列正確，沒有發(fā)生移碼突變。將ure上下游同源臂通過TA克隆分別連接到pEASY-T1載體上，再通過酶切、酶連將ure上下游同源臂 ure14連接到溫敏型質(zhì)粒 pKSV7，構(gòu)建得到重組載體pKSV7:ure14。通過PCR擴(kuò)增、HindIII/BamHI雙酶切和測序驗(yàn)證構(gòu)建成功，測序

5、結(jié)果與納豆芽孢桿菌同源性為100%，沒有出現(xiàn)突變和移碼現(xiàn)象，可以將該載體用于構(gòu)建ure缺失菌株。
　　納豆芽孢桿菌（CGMCC No.2801）的ure基因及其上下游序列與枯草芽孢桿菌168的同源性為97%。本研究采用電轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將重組載體 pKSV7:ure14分別轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌168。以培養(yǎng)至OD600為1.1的納豆芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌168制備感受態(tài)，以0.5 mol/L的甘露醇、0.38 m