口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A和3B單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的以感染牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病,嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)、國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民生活,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報(bào)的多種動(dòng)物共患傳染病之一。FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3A蛋白在病毒復(fù)制中起重要作用,可作為宿主細(xì)胞受小RNA病毒感染的標(biāo)志,而且3A蛋白與病毒的致病力和宿主范圍

2、有關(guān);3B蛋白在FMDVRNA復(fù)制合成時(shí)起引物的作用。感染動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗3AB蛋白抗體,而在疫苗免疫的動(dòng)物體內(nèi)基本不產(chǎn)生,因此,通過(guò)免疫3AB蛋白制備抗FMDV3AB的單克隆抗體,既為FMD鑒別診斷提供物質(zhì)基礎(chǔ),又為深入研究3AB蛋白及其相關(guān)聯(lián)的蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-30a(+)-FMDV-3AB,并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá),并利用Ni-NTA親和層析純化3AB,Wes

3、ternblot證實(shí)3AB可與FMDVAsia1型的牛陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),證實(shí)表達(dá)的融合蛋白具有較好的抗原性。然后以純化的3AB蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,用間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞,有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,獲得3株能穩(wěn)定分泌抗3B蛋白和6株能穩(wěn)定分泌抗3A蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1B2、1G8、1E11、4A3、4A4、5C9、5D7、9H9和10D1,并對(duì)這9株單抗進(jìn)行了

4、生物學(xué)鑒定。亞類鑒定結(jié)果顯示,182和1E11為IgM,1G8為Ig2a,其余均為IgG1亞類,輕鏈均為κ型。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明,這9株單抗均能夠識(shí)別FMDV3AB蛋白。用制備的單克隆抗體對(duì)分段表達(dá)的3AB蛋白進(jìn)行Westernblot分析,結(jié)合位點(diǎn)分別位于3A的第55aa～70aa、64aa～79aa、130aa～145aa區(qū)段,3B的第17aa～31aa、49aa～63aa和25aa～39aa內(nèi)。利用單抗4A3和1B2株,分析