基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究.pdf

1、生物傳感是基于生物分子識(shí)別及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)換，進(jìn)行目標(biāo)物檢測(cè)的一類分析方法，是分析化學(xué)與生命科學(xué)的交叉研究領(lǐng)域。比較其它分析方法，它有著不少的優(yōu)勢(shì)，特別是提高了分析速度和應(yīng)用靈活性。隨著電子、微電子和機(jī)械系統(tǒng)的進(jìn)步，便攜式、集成式傳感元件的開發(fā)，生物傳感方法研究有機(jī)會(huì)為醫(yī)療、環(huán)境保護(hù)、食品安全乃至公共安全等領(lǐng)域提供更多現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)，為公共健康與公共安全建立第一道防線。近年來(lái)，納米材料領(lǐng)域的研究不斷突破，核酸識(shí)別、核酸信號(hào)放大新技術(shù)的持

2、續(xù)發(fā)展，為構(gòu)建高靈敏、高選擇性、快速高效的新型生物傳感器提供了更完美的設(shè)計(jì)思路，為生物傳感器實(shí)現(xiàn)不同分析靶標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了更有力的平臺(tái)。本論文則基于當(dāng)前熱點(diǎn)納米材料-安全環(huán)保的碳、硅納米材料發(fā)展了三個(gè)頗具醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用前景的生物傳感器，其中有細(xì)胞信號(hào)通路重要蛋白酶-磷脂酶D的檢測(cè)，活細(xì)胞及亞細(xì)胞器的示蹤。首次報(bào)道非氧化石墨烯通過(guò)非共價(jià)生物功能化應(yīng)用于生物傳感器，也是首次展示利用無(wú)毒納米材料對(duì)細(xì)胞能量工廠-線粒體的示蹤研究效果能夠堪比

3、有機(jī)染料。同時(shí)涉及其中的納米材料-非氧化石墨烯、硅量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)的生物功能化研究都各自有小小突破，為它們?cè)谏飩鞲蓄I(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。本論文還基于核酸雜交技術(shù)和金屬離子介導(dǎo)的核酸偽雜交技術(shù)分別發(fā)展了針對(duì)生物體重要的癌癥標(biāo)記物-小RNA(microRNA)和環(huán)境污染物-汞離子的檢測(cè)技術(shù)，并且對(duì)這兩種靶標(biāo)都實(shí)現(xiàn)了高靈敏高選擇性的分析。所有研究具體內(nèi)容如下所述:
　　為了進(jìn)一步拓寬非氧化石墨烯在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，在第2

4、章中發(fā)展了一種新穎的雙層磷脂膜修飾的非氧化石墨烯復(fù)合納米材料，它是通過(guò)非氧化石墨烯大面積雙面芳香環(huán)層和已合成的脂質(zhì)體疏水烷烴夾層利用范德華力和疏水作用力形成的，并且這種非共價(jià)組裝過(guò)程不會(huì)破壞石墨烯片層的電子大共軛結(jié)構(gòu)，使得該復(fù)合納米材料保留了非氧化石墨烯卓越的電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，而表面修飾的磷脂膜層則能賦予非氧化石墨烯良好的生物相容性、親水性以及表面可控修飾性，為石墨烯的生物功能化提供了一個(gè)新的實(shí)用平臺(tái)，該復(fù)合納米材料由磷脂雙分子層和疏水的

5、還原石墨烯片組成，類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，通過(guò)利用熒光素標(biāo)記的磷脂摻雜在復(fù)合納米材料中，發(fā)展出了一個(gè)檢測(cè)磷脂酶D活性的熒光生物傳感器。該生物傳感器具有高靈敏和寬檢測(cè)范圍的特性，其檢測(cè)下限低至0.010U/L，優(yōu)于以往報(bào)道的磷脂酶D分析方法，而且基于該分析模式是一步均相法，該生物傳感器有極好的適應(yīng)性，操作簡(jiǎn)易性，以及進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高通量分析和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的可能。
　　近年來(lái)，硅納米材料憑借它出色的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)性質(zhì)，以及表面可控修飾，

6、可適應(yīng)硅材料作為半導(dǎo)體材料的特殊應(yīng)用吸引科學(xué)家們的關(guān)注，尤其是零維硅納米材料-硅量子點(diǎn)，基于硅材料本身無(wú)毒、化學(xué)惰性、生物相容性極好，非常適合生物傳感方法研究，特別是生物成像領(lǐng)域。在第3章中我們首先將電化學(xué)刻蝕法合成的硅點(diǎn)用雙氧水氧化鈍化，再用硅烷化試劑在有機(jī)相中進(jìn)一步老化，轉(zhuǎn)入水相后通過(guò)碳二亞胺/硫代琥珀酰亞胺法(EDC/Sulfo-NHS)進(jìn)行表面水溶性改性獲得最終的硅量子點(diǎn)，該硅量子點(diǎn)具有優(yōu)良的水分散性，強(qiáng)熒光性（量子產(chǎn)率30％）

7、，合適的尺寸（約4nm），非常適合作為熒光成像探針。此方法合成的硅點(diǎn)表面保留了一定數(shù)目的伯胺基團(tuán)，可以被進(jìn)一步功能化。研究中我們分別選用線粒體定位試劑三苯基膦和溶酶體定位試劑嗎啉通過(guò)EDC/Sulfo-NHS交聯(lián)法進(jìn)行功能化，并通過(guò)雙光子熒光共聚焦成像證明其示蹤效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過(guò)和商品化的有機(jī)染料對(duì)比，硅量子點(diǎn)能準(zhǔn)確、快速（約15min）對(duì)亞細(xì)胞器線粒體和溶酶體進(jìn)行定位，且成像效果不遜于有機(jī)染料探針，此外線粒體會(huì)在細(xì)胞凋亡初期腫脹

8、變圓，通過(guò)誘導(dǎo)劑引發(fā)細(xì)胞開始凋亡，實(shí)時(shí)成像圖顯示了我們合成的功能化硅量子點(diǎn)能很好的表現(xiàn)出線粒體形狀變化，進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡的示蹤，表明所得的硅量子點(diǎn)是有潛質(zhì)的生物成像探針。
　　不光是石墨烯，碳納米材料本身優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)性質(zhì)和無(wú)毒、化學(xué)惰性、容易代謝等特性促使科學(xué)家們不斷開發(fā)其在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。為了拓寬熒光碳納米材料在生物成像領(lǐng)域的發(fā)展空間，在第4章中我們合成了一個(gè)雙層脂質(zhì)體共價(jià)修飾的新型碳量子點(diǎn)，因?yàn)閭鹘y(tǒng)一步法合成出的碳點(diǎn)

9、往往光學(xué)性質(zhì)差強(qiáng)人意（量子產(chǎn)率通常低于3％），很多相關(guān)研究都著力于表面改性提高量子產(chǎn)率，例如通過(guò)氨基修飾的低聚PEG（分子量約1500）進(jìn)行表面鈍化處理，實(shí)現(xiàn)光學(xué)性能提高（量子產(chǎn)率約10％），而我們則嘗試用相似分子量的磷脂代替氨基修飾的低聚PEG對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行表面鈍化，首先通過(guò)傳統(tǒng)的硝酸回流法合成出碳點(diǎn)前體，再通過(guò)超濾裝置篩選出所需顆粒大?。ㄐ∮?0nm），同時(shí)合成好雙分子層脂質(zhì)體。利用碳二亞胺/硫代琥珀酰亞胺法將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的氨基

10、末端和碳點(diǎn)表面因氧化產(chǎn)生的羧基官能團(tuán)交聯(lián)獲得最終的碳量子點(diǎn)，該碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度比同濃度的前體碳點(diǎn)高3倍，尺寸約5nm，表面包裹的脂質(zhì)體雙分子層能賦予碳點(diǎn)優(yōu)異的生物相容性和表面可控修飾性。我們進(jìn)一步探索了碳點(diǎn)在HeLa（宮頸癌）細(xì)胞中的雙光子熒光共聚焦成像效果，實(shí)驗(yàn)證明碳點(diǎn)在細(xì)胞各個(gè)位置都有分布，說(shuō)明該方法合成的碳點(diǎn)非常適合生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　汞是高毒的環(huán)境污染物，尤其是其具有高遷移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物鏈放大

11、性等特點(diǎn)，即便是極微量的存在于環(huán)境中，對(duì)動(dòng)植物及人類的健康也是極大的威脅。在第5章中我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)非常新穎的，基于T-Hg2+-T配位化學(xué)原理，能高靈敏性、高選擇性的檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)傳感器。這項(xiàng)技術(shù)的設(shè)計(jì)思路是鄰近的聚TDNA鏈之間在Hg2+介導(dǎo)條件下產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)。先是在金電極表面，通過(guò)Au-S共價(jià)鍵，有序地組裝上一層由8個(gè)堿基組成的全TDNA單鏈探針，且該探針末端標(biāo)記了電活性物質(zhì)二茂鐵，當(dāng)沒有Hg2+存在時(shí)，電極表面的聚TDNA

12、單鏈探針都各自柔軟地趴在金盤表面，二茂鐵離金表面很近，電子發(fā)生傳遞，可檢測(cè)到二茂鐵的氧化還原電流;當(dāng)Hg2+存在條件下，最相鄰的聚TDNA單鏈探針可以成對(duì)協(xié)同性地結(jié)合Hg2+，即電極表面的探針構(gòu)象在Hg2+介導(dǎo)的T-T錯(cuò)配情況下可由柔軟的單鏈結(jié)構(gòu)變成相對(duì)剛性的類似雙鏈的結(jié)構(gòu)，這個(gè)構(gòu)象變換導(dǎo)致了二茂鐵遠(yuǎn)離電極表面，電子傳遞受阻，檢測(cè)到的氧化還原電流大大減弱。通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的變化可以判斷Hg2+的存在及定量分析。這個(gè)檢測(cè)機(jī)理已經(jīng)得到毛細(xì)管電

13、泳及一系列電化學(xué)方法的充分驗(yàn)證，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這個(gè)傳感器能在1nM-2μM之間高靈敏檢測(cè)Hg2+，檢測(cè)下限能到達(dá)0.5nM，優(yōu)于本文中介紹的其它檢測(cè)方法，并且這項(xiàng)技術(shù)表現(xiàn)出了優(yōu)異的選擇性，這是和傳統(tǒng)的電化學(xué)方法（陽(yáng)極溶出分析法ASV）檢測(cè)Hg2+最大的區(qū)別，而且這個(gè)Hg2+傳感器所需試劑非常少、操作步驟很簡(jiǎn)單又有著極好的再生性。如此經(jīng)濟(jì)高效的電化學(xué)傳感器在實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)環(huán)境中Hg2+將有很好的應(yīng)用前景。
　　MicroRNA(mi

14、RNA)在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控功能，不僅對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡有著重要的影響，而且還與許多疾病有著密切的關(guān)系，研究者發(fā)現(xiàn)在白血病、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和心血管障礙等疾病中，相關(guān)的miRNA都異常表達(dá)。由于miRNA具有核酸序列短、含量少以及相互之間序列相似性等特點(diǎn)，分析測(cè)試有一定的挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有印記雜交技術(shù)、微陣列檢測(cè)技術(shù)、基于RCA信號(hào)放大的檢測(cè)技術(shù)、陽(yáng)離子聚合物等。本論文第6章中將向大家報(bào)道一種基于雙重侵入式信號(hào)放

15、大技術(shù)(Invaderassay)高靈敏高選擇性檢測(cè)miRNA的方法。曾有研究小組基于侵入式信號(hào)放大技術(shù)檢測(cè)miRNA，但是都是將目標(biāo)miRNA作為模板探針，對(duì)相似序列的miRNA不能實(shí)現(xiàn)很好的區(qū)分，我們則是將miRNA設(shè)計(jì)成第一重循環(huán)放大的侵入式探針，并且miRNA的存在不會(huì)立即形成侵入位點(diǎn)重疊結(jié)構(gòu)，我們借鑒缺口連接PCR的原理，設(shè)計(jì)出miRNA的3'端距侵入位點(diǎn)數(shù)個(gè)核苷酸距離。當(dāng)加入嗜熱性Taq聚合酶，和相應(yīng)的核苷三磷酸，完全匹配的

16、miRNA成為引物開始從3'端開始聚合延伸，當(dāng)聚合延伸到達(dá)信號(hào)探針和模板探針雜交區(qū)的第一對(duì)核苷酸（即侵入位點(diǎn)），將距信號(hào)探針侵入位點(diǎn)核苷酸和后一位（靠近3'端）的核苷酸之間磷酸骨架斷開，信號(hào)探針5'翹起一段離開，另一段也因雜交序列變短，與模板雜交穩(wěn)定性減弱并脫離模板，遂成為第二重循環(huán)放大的引物探針。第二重循環(huán)放大類似第一重循環(huán)，也是需要借助聚合的作用才能形成侵入式結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步消弱了非特異性切刻作用，第二重循環(huán)的信號(hào)探針是5'標(biāo)記熒光團(tuán)熒