克雷伯氏桿菌噬菌體的生物學(xué)特性及其抗性菌株的選育.pdf

1、克雷伯氏桿菌是微生物法發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的重要生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)過(guò)程中若發(fā)生噬菌體感染，將影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中感染噬菌體的報(bào)道主要集中在乳制品工業(yè)以及少數(shù)的大宗化學(xué)品產(chǎn)業(yè)，1，3-丙二醇發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中噬菌體的信息比較有限，國(guó)內(nèi)尚處空白。鑒于上述情況，本論文分離出造成發(fā)酵異常的克雷伯氏桿菌的噬菌體，考察其生物學(xué)特性及其對(duì)發(fā)酵代謝的影響，對(duì)防治噬菌體污染進(jìn)行了初步的探索，并篩選了抗噬菌體的菌

2、株。
　　首先，對(duì)克雷伯氏桿菌的噬菌體進(jìn)行了鑒定、分離和分類(lèi)。以絲裂霉素C誘導(dǎo)法鑒定產(chǎn)生異常發(fā)酵的生產(chǎn)菌株溶源性噬菌體，采用敏感指示菌法及Adams雙層平板法從引起發(fā)酵異常的克雷伯氏桿菌中分離純化出一株溶源性噬菌體。通過(guò)氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示，該噬菌體對(duì)氯仿不敏感，從而表明該噬菌體無(wú)包膜，其衣殼內(nèi)不含脂類(lèi)物質(zhì)。用磷鎢酸負(fù)染法透射電鏡觀察，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行分類(lèi)，屬于有尾噬菌體目，長(zhǎng)尾噬菌體科。手工法提取噬菌體核酸，限制性?xún)?nèi)切酶EcoR

3、Ⅰ和HindⅢ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，表明該噬菌體的核酸為dsDNA。根據(jù)酶切圖譜估算的噬菌體基因組大小約為42 kb。
　　其次，測(cè)定了噬菌體的生物學(xué)特性，其最佳感染復(fù)數(shù)為1;一步生長(zhǎng)曲線顯示，噬菌體的潛伏期與裂解期均為50 min，裂解量為343個(gè)。還考察了溫度、pH、紫外線等理化因素對(duì)噬菌體活性的影響。該噬菌體對(duì)溫度比較敏感，其最適溫度為37℃，經(jīng)70℃處理30 min即完全失活。其存活的pH范圍較寬，對(duì)酸堿均有一定的

4、抗性，在pH7-8范圍內(nèi)效價(jià)最高，較耐堿性，在偏酸性條件下(pH＜4)效價(jià)降低速率較快。該噬菌體對(duì)紫外線照射非常敏感，照射3 min活性即下降90％以上，照射時(shí)間達(dá)12 min之后基本完全失活。
　　再次，考察了噬菌體對(duì)克雷伯氏桿菌生長(zhǎng)和發(fā)酵代謝的影響。結(jié)果顯示，與正常克雷伯氏桿菌相比，感染噬菌體的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期約8h，最高菌體濃度下降了33％。比較兩種情況下的主要代謝產(chǎn)物生成情況，其主產(chǎn)物1，3-丙二醇產(chǎn)量下降38％，代謝流

5、偏向了乳酸等有機(jī)酸途徑。為探索針對(duì)噬菌體污染的防治措施，考察了Ca2+、三種不同濃度的表面活性劑以及不同濃度的氨芐青霉素對(duì)降低噬菌體影響菌體生長(zhǎng)的作用，結(jié)果顯示所考察的三種方法條件對(duì)噬菌體均無(wú)有效的抑制作用。
　　最后，篩選抗性菌株。通過(guò)高濃度噬菌體侵染條件下的自發(fā)突變經(jīng)初篩、復(fù)篩得到一株抗性菌株。發(fā)酵驗(yàn)證顯示，該菌株菌體生長(zhǎng)未出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，表現(xiàn)出了一定的抗性。但代謝流仍然偏向乳酸等有機(jī)酸途徑，導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量偏低。進(jìn)一步采