牛膠原蛋白三維載體支架的制備及其與人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性研究.pdf

1、角膜是位于眼球最前端的一層透明薄膜組織，在保護眼球、提供屈光力和保障視功能方面發(fā)揮了重要功能。熱燙傷、化學(xué)燒傷、機械損傷以及病菌感染等所造成的角膜病，是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病。雖然角膜移植是治療角膜病盲的唯一有效手段，但由于捐獻角膜嚴(yán)重匱乏，導(dǎo)致絕大多數(shù)患者無法通過角膜移植恢復(fù)視力，而體外構(gòu)建的組織工程角膜作為理想的捐獻角膜替代品，是目前解決供體角膜匱乏的根本途徑。在組織工程角膜的體外構(gòu)建研究中，載體支架起關(guān)鍵作用，能夠為種子細(xì)胞

2、提供結(jié)構(gòu)支撐并起到模板作用以引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。用于構(gòu)建組織工程角膜的支架材料主要有異種角膜基質(zhì)等天然材料、人工合成高分子材料以及膠原和殼聚糖等生物大分子復(fù)合材料。與其它支架材料相比，膠原在生物相容性、免疫原性、可降解性等方面均具有明顯的優(yōu)勢。鑒于重組人膠原蛋白價格昂貴等問題，在一定程度上限制了利用膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架的研發(fā)和應(yīng)用。而牛膠原蛋白來源豐富，提純方法簡便且得率高，在膠原蛋白三維載體支架的制備和推廣應(yīng)用方面

3、日益表現(xiàn)出良好的前景。但到目前為止，仍未見到有關(guān)提取和純化牛膠原蛋白以及利用牛膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架及其生物相容性的研究報道。
　　本文以牛肌腱為材料提取牛膠原蛋白，然后利用牛膠原蛋白(130 mg/mL)，采用凍干法制成支架凍干片，再以化學(xué)交聯(lián)劑EDC/NHS進行交聯(lián)，然后對其理化性質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)進行檢測。結(jié)果顯示交聯(lián)劑比例EDC∶NHS=4.125∶1時制備的支架表面平整，厚度均勻;光學(xué)透明度高，透光率為41.5％-8

4、9.6％(WL=300 nm-800nm);含水量約83.66％±1.75％;機械性能較好;載體支架結(jié)構(gòu)較致密，且形成多孔的片層結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果顯示，該方法制備的牛膠原蛋白載體支架在光學(xué)透明度、含水量和組織結(jié)構(gòu)方面均與天然角膜相似，保證了后續(xù)探索實驗的開展。
　　本文對來源于本實驗室自主建立的人角膜基質(zhì)細(xì)胞系的第68代人角膜基質(zhì)細(xì)胞(HCSC)進行體外培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的HCSC呈現(xiàn)典型的纖維樣，增殖旺盛，群體倍增時間為3

5、9.03 h;細(xì)胞染色體組型正常;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HCSC標(biāo)志蛋白（波形蛋白）和功能蛋白（間隙連接蛋白43、整聯(lián)蛋白、乙醛脫氫酶3A1）均陽性表達;實時定量PCR顯示HCSC能夠正常表達生長相關(guān)因子（Kras、mTOR和STAT3）、增殖相關(guān)因子(p27、CDK2)以及標(biāo)志蛋白(vimentin)。綜合以上結(jié)果表明HCSC保持了HCSC的特性，且具有生長增殖的能力和發(fā)揮正常功能的潛力，可用于牛膠原蛋白載體支架生物相容性的相關(guān)研究。

6、r>　　本文利用該HCSC對上述載體支架的生物相容性進行檢測。結(jié)果顯示載體支架浸提液對HCSC無明顯毒性作用;將HCSC接種在載體支架上培養(yǎng)5d，細(xì)胞能黏附在支架上生長，且有少量細(xì)胞遷入到支架內(nèi)部，細(xì)胞能夠陽性表達標(biāo)志蛋白（波形蛋白）和功能蛋白（間隙連接蛋白43、整聯(lián)蛋白、乙醛脫氫酶3A1），以及生長相關(guān)因子（Kras、mTOR和STAT3）、增殖相關(guān)因子(p27、CDK2)和標(biāo)志蛋白(vimentin)。以上結(jié)果表明制備的牛膠原蛋白載