致病性副溶血性弧菌的恒溫擴(kuò)增檢測方法的研究.pdf

1、副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，食用感染了攜帶致病因子的副溶血性弧菌的海鮮會造成食物中毒，主要表現(xiàn)在腹瀉，痙攣，惡心，嘔吐等癥狀。隨著全球感染副溶血性弧菌的案例增多，韓國，日本，和歐盟等國家已經(jīng)把副溶血性弧菌的風(fēng)險評估工作提上日程。因此，能否快速檢測出食品中的致病性副溶血性弧菌已成為公眾健康的重要問題。然而在自然環(huán)境和食品中，并非所有的副溶血性弧菌都攜帶致病因子，其中耐熱溶血毒素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血毒素（TRH）已被確認(rèn)為兩種

2、重要的毒力因子。
　　為了提供方便簡捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)致病性副溶血性弧菌的檢測方法。本文分別以對副溶血性弧菌耐熱溶血毒素，耐熱相關(guān)溶血毒素為模板建立了兩種常見水產(chǎn)品病原菌的LAMP檢測方法，對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，確定了其特異性及靈敏度，同時發(fā)展出對tdh和trh基因同時檢測技術(shù)以及結(jié)合免疫磁珠建立了IMS-dLAMP方法，并將所建立的檢測方法應(yīng)用到了實際樣品中，結(jié)果如下：
　　1.基于tdh基因的副溶血性弧

3、菌LAMP檢測方法的建立
　　以tdh毒力基因為靶基因，分別設(shè)計一組引物，進(jìn)行引物的驗證，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化，特異性分析以及靈敏度實驗。tdh基因LAMP的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為6mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。加入SYBR Green I后，能用肉眼進(jìn)行結(jié)果的判斷。常見細(xì)菌作對照，顯示反應(yīng)引物具有很強(qiáng)的特異性。tdh基因的LAMP反應(yīng)體系對于純培養(yǎng)物的靈敏度檢測

4、中，反應(yīng)的靈敏度達(dá)到8.20×102 CFU/mL。人工污染蝦樣的靈敏度檢測限為9.40×102 CFU/25g。而PCR的檢測限為104 CFU/mL。即LAMP的檢測限比PCR低100倍。
　　2.基于trh基因的副溶血性弧菌LAMP檢測方法的建立
　　trh基因 LAMP的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為8mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。產(chǎn)物經(jīng)過熒光染色后發(fā)生顏色變化，產(chǎn)

5、物檢測方便。trh基因的LAMP反應(yīng)體系純培養(yǎng)物的靈敏度檢測中，反應(yīng)的靈敏度達(dá)到2.64×104 CFU/mL。人工污染蝦樣的靈敏度檢測限為9.14×103 CFU/25g。PCR檢測限為106 CFU/mL，檢測限高于LAMP檢測100倍。
　　3.基于tdh和trh基因的副溶血性弧菌多重LAMP檢測方法的建立
　　tdh和trh多重環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)的最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為8mM，dNTPs濃度為1.0mM，反應(yīng)

6、體系在63℃下45min即能有理想擴(kuò)增效果。以8株致病性弧菌，5株非致病性副溶血性弧菌及8株非副溶血性弧菌DNA作為模板進(jìn)行特異性測試，同時，采集了11個月3個水產(chǎn)品市場的2種蝦，將dLAMP與PCR結(jié)果進(jìn)行比較，沒有發(fā)生交叉反應(yīng)說明引物具有高度的特異性。在靈敏度實驗中，純培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到了6.42×101 CFU/mL（DNA濃度為1.65 fg/μL），人工污染樣品的靈敏度達(dá)到了8.0×101 CFU/25g（DNA濃度為0.83

7、2 pg/μL）。與PCR比較，高2-3個數(shù)量級，與熒光定量PCR不相上下。但所需儀器簡便，可在基礎(chǔ)研究室操作。
　　4.免疫磁珠IMS與dLAMP結(jié)合檢測副溶血性弧菌
　　免疫磁珠吸附能夠有效的加快預(yù)增菌的時長。但是其特異性的缺陷需要結(jié)合生物學(xué)方法彌補(bǔ)。本研究對低濃度的人工污染樣品進(jìn)行培養(yǎng)，免疫磁珠富集，dLAMP技術(shù)檢測致病性副溶血性弧菌，從結(jié)果可以看出當(dāng)濃度低至0.08 logCFU/25g時，通過培養(yǎng)3.5h后，能夠