產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸重組菌的優(yōu)化和發(fā)酵過程調(diào)控研究.pdf

1、5－氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物合成葉綠素、血紅素、卟啉和維生素B12等四吡咯化合物的前體物質(zhì)。ALA除作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光動(dòng)力學(xué)農(nóng)藥外，還在臨床上廣泛用作光化療劑和診斷劑。代謝工程技術(shù)在ALA的開發(fā)中顯示出很大的前景，但此前獲得的工程菌產(chǎn)量與誘交菌株相比還比較低，底物的轉(zhuǎn)化率不高，并且工藝尚不成熟，離產(chǎn)業(yè)化尚有距離。
　　 本工作的目的是運(yùn)用代謝工程原理和技術(shù)，構(gòu)建

2、高效率產(chǎn)ALA的重組大腸桿菌，并優(yōu)化工程菌的發(fā)酵條件和過程控制策略，提高ALA的生產(chǎn)水平，降低ALA的生產(chǎn)成本，為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)及其在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 本文首先克隆了類球紅細(xì)菌的hemA基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a(+)-Rs.hemA。然后通過Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌MG1655的琥珀酸脫氫酶基因(sdhAB)，獲得了MG1655(sdhAB-)。大腸桿菌MG1655和MG1655

3、(sdhAB-)經(jīng)過溶源化處理后，構(gòu)建了工程菌MG1655(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA和MG1655(sdhAB-)(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA用于ALA的生產(chǎn)?？紤]到培養(yǎng)基中葡萄糖、甘氨酸和琥珀酸的濃度對(duì)于ALA的合成具有重要影響，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了培養(yǎng)基中這些成分的濃度并考察了其交互作用。工程菌經(jīng)過搖瓶試驗(yàn)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)sdhAB缺陷型菌株具有更好的ALA合成潛力。采用工程菌MG1655(sdhAB

4、-](DE3)/pET28a-Rs.hemA在151發(fā)酵罐上進(jìn)行批次發(fā)酵，ALA的積累量達(dá)到2.1 g/l，相對(duì)琥珀酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)40.1％。
　　 采用pKD46介導(dǎo)的Red同源重組技術(shù)，成功將嗜熱棲熱菌的ALA脫水酶基因敲入到大腸桿菌。BW25113中替換了大腸桿菌自身的ALA脫水酶基因，獲得了ALA脫水酶基因替換菌株。考慮到表達(dá)的ALA合成酶在大腸桿菌BW25113和MG1655等菌株中的活力比較低，提高ALA合成酶的活

5、力成為進(jìn)一步研究的首選目標(biāo)。重組類球紅細(xì)菌ALA合成酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)優(yōu)化，其中Rosettaq(DE3)為稀有密碼子優(yōu)化型菌株。對(duì)ALA合成酶表達(dá)條件和培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，相比于宿主BL21(DE3)，Rosetta(DE3)表達(dá)的ALA合成酶活力更高，ALA產(chǎn)量也更高。在51發(fā)酵罐上進(jìn)行了ALA合成的實(shí)驗(yàn)，以工程菌Rosetta(DE3)/pET28a(+)-Rs.h

6、emA為出發(fā)菌株，ALA積累量最高達(dá)3.8 g/l(29 mM)。
　　 對(duì)工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA合成ALA進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在批次發(fā)酵中，確定了葡萄糖和甘氨酸的添加能夠有效促進(jìn)ALA的合成。對(duì)于前體流加策略進(jìn)行了研究，確定了合適的前體配比，ALA的產(chǎn)量最高達(dá)4.1g/l?？紤]到流加發(fā)酵過程的pH控制對(duì)于細(xì)胞生長和ALA合成有重要影響，設(shè)計(jì)了新型的兩階段pn反饋控制的流加策

7、略，發(fā)酵前6h的pH值控制在5.9隨后利用前體流加控制pH值在6.2，ALA積累量最高達(dá)6.6g/l(50mM)。
　　 為了增強(qiáng)來源于放射形土壤桿菌(A.radiobacterzju-0121)的ALA合成酶基因的表達(dá)，根據(jù)此前的研究結(jié)果，選擇大腸桿菌Rosetta(DE3)作為宿主構(gòu)建了高效表達(dá)的重組菌。對(duì)重組菌細(xì)胞破碎液中的ALA合成酶進(jìn)行了蛋白電泳分析和活力分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宿主Rosettaq(DE3)表達(dá)的ALA合成酶