重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ發(fā)酵過程優(yōu)化.pdf

1、為了實(shí)現(xiàn)類人膠原蛋白Ⅱ(Human-Like Collagen Ⅱ，簡(jiǎn)稱HCLⅡ)的規(guī)模化生產(chǎn)，提高類人膠原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量，本研究主要從發(fā)酵過程中pH、溫度培養(yǎng)模式以及發(fā)酵過程補(bǔ)料流加策略三方面對(duì)對(duì)重組大腸桿菌BL213.7在30L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ過程進(jìn)行了考察。
　　 在對(duì)發(fā)酵過程pH的優(yōu)化中，將pH控制在6.0-7.8之間時(shí)，監(jiān)測(cè)pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及類人膠原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量的影響，從而確定出合理的pH控制策略增加類人膠

2、原蛋白Ⅱ的產(chǎn)量。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，在pH7.5條件下細(xì)胞濃度達(dá)到最大，為68.5g/L，但類人膠原蛋白Ⅱ的濃度為8.5g/L。在pH6.8條件下，類人膠原蛋白Ⅱ濃度達(dá)到最大，為10.5g/L，但其細(xì)胞濃度只有60.9g/L。同時(shí)，對(duì)發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物有機(jī)酸的含量也進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。隨著發(fā)酵過程pH值的升高，總有機(jī)酸的量也相應(yīng)的增加，當(dāng)發(fā)酵過程pH控制在7.8時(shí)，總有機(jī)酸濃度達(dá)到最大，為15.61g/L。為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量以及提高底物的利用

3、率，采用pH兩階段控制策略控制發(fā)酵，最終類人膠原蛋白Ⅱ濃度可達(dá)到11.3g/L，較恒pH條件下提高了7.61％。
　　 在對(duì)發(fā)酵過程溫度培養(yǎng)模式的選擇方面，采用三階段的溫度培養(yǎng)模式，在誘導(dǎo)前3h，分別升溫至36℃、37℃、38℃培養(yǎng)至誘導(dǎo)期，考察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及類人膠原蛋白Ⅱ表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，36℃和38℃溫度培養(yǎng)模式下所得產(chǎn)量相對(duì)較低。所以發(fā)酵過程采用發(fā)酵前期34℃進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)前3h升溫至37℃培養(yǎng)，最后升溫誘導(dǎo)，在

4、37℃溫度培養(yǎng)模式下獲得了較高的細(xì)胞密度，為69.4g/L；且類人膠原蛋白Ⅱ的表達(dá)量最高，為11.93g/L。相較于前期研究的基礎(chǔ)上，細(xì)胞密度與類人膠原蛋白Ⅱ的表達(dá)量分別提高了4.9％和5.5％。
　　 在對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化的過程中，考察了誘導(dǎo)前后不同補(bǔ)料流加方式對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)前控制比生長(zhǎng)速率0.15h-1有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞密度為73.4g/L，同時(shí)類人膠原蛋白Ⅱ的表達(dá)量為12.43g/L。當(dāng)發(fā)酵過

5、程進(jìn)入誘導(dǎo)期后，分別采用pH-stat、指數(shù)型、不同速率的間歇型以及階段遞減型補(bǔ)料流加策略對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行控制，同時(shí)對(duì)發(fā)酵過程的不同參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同補(bǔ)料流加策略分析其對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果所設(shè)計(jì)出來的階段遞減的方式進(jìn)行補(bǔ)料，有利于菌體的生長(zhǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到78.2g/L；同時(shí)類人膠原蛋白Ⅱ的表達(dá)量也最高，為13.28g/L。在前期研究的基礎(chǔ)之上，產(chǎn)量提高了11.31％。因此，整個(gè)發(fā)酵過程的補(bǔ)料調(diào)控策略對(duì)