重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶制劑穩(wěn)定性的研究.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGT酶,EC2.4.1.19)能夠通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)將淀粉及淀粉類似物轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精。由于環(huán)糊精能與客體分子形成包含復(fù)合物,改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì),因而在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣,CGT酶已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作中,成功實(shí)現(xiàn)了Paenibacillus maceransα-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-CGT酶)在大腸桿菌中的胞外分泌表達(dá)。但研究中我們發(fā)現(xiàn)無(wú)

2、論是天然α-CGT酶還是重組酶酶制劑的熱穩(wěn)定性均較差,不利于規(guī)模化的工業(yè)應(yīng)用。為了提高重組α-CGT酶的穩(wěn)定性,本研究從基因水平、大分子化學(xué)修飾水平和改變酶分子微環(huán)境水平三個(gè)方面對(duì)α-CGT酶的熱穩(wěn)定性開展了研究。此外,用圓二色光譜(CD)分析了α-CGT酶的熱穩(wěn)定性與其天然結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,并對(duì)多羥基化合物對(duì)酶分子的穩(wěn)定機(jī)理做了初步研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)純化了來(lái)源于P.macerans的天然α-CGT酶以及來(lái)源于

3、Escherichia coli和Bacillus subtilis的重組酶,經(jīng)熱處理后發(fā)現(xiàn)來(lái)源于P.macerans,E.coli和B.subtilis的α-CGT酶殘酶活分別為28％,30％和25％?？梢?來(lái)源于不同菌種的α-CGT酶的熱穩(wěn)定性相似,若直接使用,均不能達(dá)到工業(yè)用酶制劑的要求。根據(jù)三種菌對(duì)α-CGT酶的產(chǎn)量,最終確定將來(lái)源于E.coli的重組α-CGT酶作為本課題后續(xù)的研究對(duì)象。
　　 (2)分析了重組α-CG

4、T酶的最適貯存pH和貯存蛋白濃度。結(jié)果顯示pH6.5,蛋白含量為4 mg/mL的α-CGT酶熱穩(wěn)定性最好。將蛋白含量為4 mg/mL,pH6.5的粗酶制劑分別在4℃、25℃和37℃貯存。當(dāng)酶液在4℃和25℃貯存時(shí),T1/2分別為108 d和50 d,在37℃貯存時(shí)α-CGT酶的酶活很快下降,T1/2為2.9 d,一周后酶活完全喪失。
　　 (3)采用定點(diǎn)突變技術(shù)研究了鹽橋?qū)μ岣咧亟Mα-CGT酶熱穩(wěn)定性的影響。對(duì)突變體的研究表明,

5、單突變酶CGTM-1(K192R)熱穩(wěn)定性較未突變的沒有太大提高;突變?nèi)齻€(gè)氨基酸后的突變酶CGTM-3(T185S/I186Y/K192R)熱穩(wěn)定性有了明顯提高。在50℃水浴30min后突變酶CGTM-3殘酶活是對(duì)照的兩倍多。將蛋白含量為4 mg/mL,pH6.5的突變酶CGTM-3粗酶制劑分別在4℃、25℃和37℃貯存,定時(shí)取樣測(cè)酶活,得出其T1/2分別為120 d、80 d和7 d。
　　 (4)采用戊二醛交聯(lián)的方法研究了化

6、學(xué)修飾對(duì)提高重組α-CGT酶穩(wěn)定性的影響。Α-CGT酶經(jīng)戊二醛交聯(lián)成大分子聚合物后,50℃水浴30 min發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比酶的熱穩(wěn)定性有所提高,但是交聯(lián)過程中酶活損失了50％。后用α-CGT酶粗酶液進(jìn)行交聯(lián),雖然交聯(lián)過程酶活損失有所降低,酶的穩(wěn)定性也有所提高,但仍不能滿足工業(yè)化應(yīng)用要求。
　　 (5)采用向α-CGT酶液中添加化學(xué)添加劑研究了酶分子微環(huán)境的改變對(duì)提高重組α-CGT酶的穩(wěn)定性的影響。當(dāng)單獨(dú)加入各種保護(hù)劑在50℃水浴1

7、 h和室溫放置108 d后,發(fā)現(xiàn)含有20％甘油的酶液穩(wěn)定性最好,與未加任何添加劑的對(duì)照酶液相比仍有91％和50％的酶活,對(duì)照酶液在50℃水浴1 h后僅有小于10％的活性,室溫放置108 d后已經(jīng)沒有酶活。明膠、CaCl2和PEG400也有一定的保護(hù)效果。將四種保護(hù)劑分別以最佳濃度組合疊加添加到α-CGT酶發(fā)酵液中40℃貯存45 d,發(fā)酵液中α-CGT酶的殘酶活幾乎不變,維持在100％左右。采用圓二色譜(CD)研究不同條件下酶的熱穩(wěn)定性變