耐熱淀粉酶基因工程菌的表達及應用.pdf

1、本次研究的耐熱淀粉酶是一種特殊的淀粉改良劑，他們與一般的淀粉酶不同是，對可溶性淀粉、支鏈淀粉、β-環(huán)化糊精等多種底物都具有轉糖基和降解作用，水解生成具有保健作用的麥芽糖或潘糖。本課題在已有耐熱淀粉酶基因工程菌的基礎上分別用乳糖和IPTG誘導來研究該酶的表達條件，然后研究酶的分離純化與酶學性質，最后研究了溫控型耐熱淀粉酶基因工程菌的表達條件，為該酶的工業(yè)化應用打下了基礎。
　　 1.論文首先對耐熱淀粉酶基因工程菌培養(yǎng)條件進行了研究

2、，該工程菌培養(yǎng)基經過優(yōu)化分析后得到LB培養(yǎng)基為最佳表達培養(yǎng)基。其最佳表達條件：菌濃OD600為0.6、IPTG濃度達到0.6mmol/l、pH為6.0、誘導溫度為37℃、誘導時間5h。
　　 2.其次，對耐熱淀粉酶基因工程菌誘導劑組分進行了研究。在乳糖單獨誘導時該重組耐熱淀粉酶的最佳表達條件為乳糖濃度為0.5％(g/100ml)，菌濃為3.0、誘導溫度為37℃、誘導時間為5h、pH5.0，其酶活僅是IPTG單獨誘導時酶活的10％

3、，因此不能由乳糖來取代IPTG的誘導；乳糖與IPTG共同誘導麥芽糖基淀粉酶的最佳表達條件為乳糖濃度為0.5％(g/100ml)、IPTG濃度為0.2mmol/l、菌濃為2.0、誘導溫度為37℃、誘導時間為4h、pH7.0、其IPTG的用量是IPTG單獨誘導時的1/3，酶活達到由單獨IPTG誘導酶活的80％，因此IPTG與乳糖共同誘導可以取代由IPTG單獨誘導。
　　 3.再次，對表達出來的重組耐熱淀粉酶進行了分離純化與酶學性質研

4、究。通過重組耐熱淀粉酶在基因表達是帶有GST融合蛋白標簽的特點，利用GST柱純化了該重組酶，該純化酶的活性很高，達到12000U/g，其分子量為90kDa。該重組酶的最佳反應溫度為60～70C，將該重組酶分別置于35℃和4℃保藏并定期取樣測量酶的剩余活力，發(fā)現酶在35℃放置3天后其剩余活力為原來的50％；在4℃下，保藏2周后酶活下降一半。該重組酶最適pH5.4～7.8，且pH值穩(wěn)定性較好。該重組酶寬廣的耐熱性、較寬的pH穩(wěn)定性為酶在工業(yè)

5、上的應用打下了基礎。
　　 4.論文的第四個研究內容是對該重組耐熱淀粉酶的催化產物進行了研究。經過HPLC luna NH2柱檢測發(fā)現耐熱淀粉酶與以淀粉為底物以及與以β-環(huán)狀糊精為底物進行催化反應所得產物均是麥芽糖和葡萄糖。對水解β-環(huán)狀糊精的機理研究發(fā)現，該重組耐熱淀粉酶是先打開β-環(huán)狀糊精的環(huán)，然后以麥芽糖為一個單位進行水解，最后的產物為麥芽糖與葡萄糖，其比例為3∶1；在耐熱淀粉酶的應用上，將酶固定化后通過控制反應時間可以制

6、備低聚糖；其與β-環(huán)狀糊精葡聚糖轉移酶協(xié)同反應降解淀粉時，兩者的配比為：在耐熱淀粉酶酶活的酶活為50U/ml，β-環(huán)狀糊精葡聚糖轉移酶酶活為2000U/ml時，體積比為2∶1混合，反應溫度為40-50℃，反應pH為7.0時與催化淀粉效果最好。
　　 5.論文最后優(yōu)化了溫控型耐熱淀粉酶基因工程菌的表達條件。通過優(yōu)化得出溫控型耐熱淀粉酶工程菌最佳表達條件為：發(fā)酵溫度為30-32℃，pH6.0，菌濃為OD600為1.2，誘導溫度為：3