低桔霉素紫色紅曲霉菌株的構(gòu)建及其色素發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、紅曲霉(Monascus)是我國重要的微生物資源，是生產(chǎn)紅曲米、紅曲紅及其他功能性紅曲的主要菌種，被廣泛運(yùn)用于現(xiàn)代工業(yè)中。但自從具有腎毒性的桔霉素被發(fā)現(xiàn)后，紅曲產(chǎn)品的安全性引起了人們的關(guān)注，其應(yīng)用范圍也受到了一定的限制。因此，獲得不產(chǎn)或低產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株，對于紅曲工業(yè)的發(fā)展意義重大。
　　 本研究提供了一種構(gòu)建低桔霉素紅曲霉工程菌的方法。在生物信息學(xué)指導(dǎo)下，應(yīng)用重疊延伸PCR(gene splicing by overlap

2、extension PCR，SOE PCR)技術(shù)制備桔霉素合成酶相關(guān)基因pksCT的轉(zhuǎn)錄激活因子ctnR的無效等位基因片段，通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)(REMI)的方法轉(zhuǎn)化紅曲霉原生質(zhì)體，借助同源重組方式置換ctnR基因，實(shí)現(xiàn)了對該轉(zhuǎn)錄激活因子的敲除。利用桔霉素對枯草芽孢桿菌的抑制特征對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選，并對獲取的低產(chǎn)桔霉素菌株運(yùn)用分子生物學(xué)方法(PCR)及高效液相色譜分析進(jìn)行了驗證。與出發(fā)菌株相比，轉(zhuǎn)化子桔霉素產(chǎn)量降低了58％，而色素產(chǎn)量

3、提高了30％。
　　 對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，并采用添加酵母破碎的方法對其紅曲色素的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行了優(yōu)化。通過在不同的時間往接種了紅曲霉并開始培養(yǎng)的搖瓶中加入不同量的酵母破碎液，研究在酵母破碎液作用下，菌體生長及醇溶性及水溶性色素產(chǎn)量的變化，發(fā)現(xiàn)在500 mL的三角瓶裝液150 mL情況下，接種紅曲霉培養(yǎng)48 h后加入1.5 mL酵母破碎液(50 mL OD600咖為1.8的發(fā)酵液碎離心后菌體用15 mL緩沖液重懸