蘋果渣與棉粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)NSP酶的研究.pdf

1、蘋果渣與棉粕產(chǎn)量巨大，但目前尚未對其進(jìn)行充分的綜合利用，這不僅是資源的浪費，也帶來了環(huán)境污染問題。另一方面發(fā)酵工業(yè)普遍采用的常規(guī)原料，如淀粉、葡萄糖、蔗糖等碳源，豆粕、麩皮、蛋白胨等氮源，近年來缺口很大，價格飛升，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品成本上升，很多附加值較低的產(chǎn)品出現(xiàn)虧損。因此，本文擬將碳水化合物含量豐富的蘋果渣與蛋白質(zhì)含量豐富的棉粕用作碳源與氮源，部分取代常規(guī)發(fā)酵原料，生產(chǎn)NSP酶，以降低生產(chǎn)成本，部分解決發(fā)酵工業(yè)與人爭糧、與畜爭飼的問題，提

2、升這些殘渣資源的價值，同時也有利于環(huán)境保護(hù)。 1、棉酚對微生物的影響及其生物脫毒 以棉粕作為發(fā)酵原料，必須考慮棉酚對發(fā)酵過程的影響與產(chǎn)品中棉酚的殘留問題。研究結(jié)果表明，棉酚對米曲霉F5、黑曲霉HG-1、黑曲霉F1、黑曲霉F2、黑曲霉F3、米曲霉F4等真菌孢子的萌發(fā)具有一定的抑制作用。在孢子萌發(fā)的初期，抑制效應(yīng)比較明顯，在6h時，含棉酚10μg/mL的培養(yǎng)基中米曲霉F5孢子的萌發(fā)率僅為對照的36.4％，但隨著時間的延長，這

3、種抑制效應(yīng)不再明顯，這說明棉酚只能抑制孢子的萌發(fā)，但不能殺死孢子。棉酚對真菌菌絲的生長具有一定的影響，但未達(dá)到顯著水平，棉酚含量為10μg/mL的培養(yǎng)基中菌絲生長沒有受到明顯的抑制。 實驗所采用的微生物對棉粕脫毒都有一定的效果，但不同菌種以及同一菌種的不同菌株之間棉酚脫毒能力相差很大，其中白地霉G07的脫毒能力最強(qiáng)。采用Plackett-Burman實驗設(shè)計與響應(yīng)面實驗設(shè)計對白地霉G07固態(tài)發(fā)酵棉粕脫毒的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果標(biāo)明

4、，最佳培養(yǎng)基組成為1.63％(w/w)(NH4)2SO4，0.10％(w/w)KH2PO4，0.05％(w/w)MnSO4，0.1％(w/w)MgSO4，0.2％(w/w)CaCl2，初始含水量為62.19％(w/w)。在上述最佳培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h，基質(zhì)中自由棉酚的含量由144.0μg/g下降至30.42μg/g，這表明白地霉G07具有較高的棉酚脫毒能力。對干重減重與棉酚殘留量的回歸分析表明，在0～48h期間，棉酚脫毒率與菌體生

5、長呈高度線性相關(guān)。 體外消化實驗表明，生物脫毒樣品中的結(jié)合棉酚比FeSO4脫毒樣品中的結(jié)合棉酚在體外消化過程中更穩(wěn)定，也就是生物脫毒樣品比FeSO4脫毒樣品的安全性要高。生物脫毒后棉粕的營養(yǎng)價值得到了提高，粗蛋白與精蛋白含量提高顯著，分別達(dá)12.6％與19.7％：氨基酸總量與必需氨基酸含量也大幅度提高，分別達(dá)17.0％與36.4％，蛋氨酸、賴氨酸與蘇氨酸含量分別提高46.9％，21.0％與59.3％。 2、黑曲霉HG-1

6、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶 蘋果渣中果膠含量高，可誘導(dǎo)微生物分泌大量的果膠酶，是生產(chǎn)果膠酶的良好原料。本文選用果膠酶產(chǎn)量較高的黑曲霉HG-1為生產(chǎn)菌種，采用單因子實驗和正交實驗對其固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為蘋果渣10g、棉粕10g、(NH4)2SO40.2g、K2HPO40.06g、初始水分含量60％；最佳裝料量為每瓶20g干料，30℃恒溫培養(yǎng)48h，果膠酶酶活力可達(dá)22248 U/g。 同時，對所產(chǎn)果膠酶

7、的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，該酶酶促反應(yīng)最適溫度為45℃，最適pH為5.0：在50℃以下，pH3.0～6.0時穩(wěn)定性良好；Ca2+、Mg2+、Fe2+對該酶有激活作用，而Ba2+、Mn2+、Zn2+有抑制作用。 3、黑曲霉F1與F3固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶、蛋白酶與纖維素酶 與單一菌種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵具有更多的優(yōu)勢，多菌種在基質(zhì)利用能力上互相補(bǔ)充，可以在價格低廉、營養(yǎng)組成復(fù)雜的基質(zhì)上良好生長。本文所采用的兩株黑曲

8、霉具有不同的酶系，黑曲霉F1雖然對纖維素類物質(zhì)的具有很強(qiáng)的分解能力，但在以棉粕為氮源的發(fā)酵體系中，相對較弱的蛋白質(zhì)分解能力成為其生長的限制性因素；與此相反，黑曲霉F3雖然對蛋白質(zhì)的分解能力很強(qiáng)，但在以蘋果渣為碳源的發(fā)酵體系中，相對較弱的纖維素類物質(zhì)的分解能力成為其生長的限制性因素；二者進(jìn)行混菌發(fā)酵時，酶系作用互補(bǔ)，雙方均可得到更好的生長，發(fā)酵產(chǎn)物的酶系組成更為合理，既有纖維素類物質(zhì)的水解酶類，也含有蛋白質(zhì)的水解酶類，同時，酶活水平更高。

9、研究結(jié)果表明，混菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為蘋果渣與棉粕1:1(w/w)，(NH4)2SO41％(w/w)，KH2PO40.1％(w/w)，黑曲霉F1與F3最佳配比為2:1(w/w)，接種量0.4％(w/w)，30℃恒溫培養(yǎng)48h；果膠酶、蛋白酶、和纖維素酶活力分別達(dá)到21168 U/g，3585 U/g和1208U/g。 除蛋白質(zhì)含量較低外，蘋果渣中果膠、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高也是制約其飼用價值的限制性因素。在發(fā)酵過程中，果膠與

10、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率分別為99.0％和66.1％，可消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用。另外，發(fā)酵過程中低分子糖類被利用，蛋白質(zhì)與氨基酸含量顯著提高，營養(yǎng)價值得到全面的改善。 4、黑曲霉SL-05固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶、纖維素酶與β-甘露聚糖酶 除果膠酶、纖維素酶外，β-甘露聚糖酶與木聚糖酶等其他NSP酶也可以采用蘋果渣為主要原料進(jìn)行生產(chǎn)。本文以蘋果渣為碳源，通過單因素實驗和統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計，采用回歸分析研究了黑曲霉SL-05固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β

11、-甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶的工藝條件，確定了菌株SL-05發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基：棉粕和蘋果渣比例1:1(w/w)、尿素2％(w/w)、葡萄糖2％(w/w)、KH2PO40.12％(w/w，β-甘露聚糖酶)、0.06％(w/w，木聚糖酶)、0.09％(w/w，纖維素酶)，含水率60％(w/w，β-甘露聚糖酶)、65％(w/w，木聚糖酶)、62％(w/w，纖維素酶)。最佳的培養(yǎng)時間為48 h，此時未見孢子生成，酶活值已經(jīng)達(dá)到了較高水平

12、。在最佳條件下，β-甘露聚糖酶、木聚糖酶與纖維素酶的酶活力分別為296 U/g(干曲)、6347 U/g(干曲)與66032 U/g(干曲)，比優(yōu)化前分別提高了61％、49％、53％。發(fā)酵后大部分氨基酸含量增加，特別是幾種常見限制性氨基酸，賴氨酸、蛋氨酸與組氨酸分別提高了38％、85％、69％。 對β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，三種酶均為酸性酶，最佳反應(yīng)pH分別為5.0、5.0、4.5，在pH3.5～

13、6.0范圍內(nèi)處理6 h和1 h殘余酶活均保持在85％以上；三個酶的最適反應(yīng)溫度分別是80℃、55℃、75℃，β-甘露聚糖酶和纖維素酶熱穩(wěn)定性較好，β-甘露聚糖酶50℃處理6 h、纖維素酶60℃處理60 min后剩余酶活都保持在80％以上，而木聚糖酶60℃處理60 min后殘余酶活只剩下17.35％。β-甘露聚糖酶酶促反應(yīng)的Km和Vmax分別是0.83 g/L、166.67μmol/min。實驗還研究了金屬離子對β-甘露聚糖酶的影響，結(jié)果

14、表明，F(xiàn)e2+與Mg2+對酶活有激活作用，其中Fe2+的激活作用最為顯著，可達(dá)127％；Cu2+對β-甘露聚糖酶的酶活有明顯的抑制作用(91％)；Ca2+在濃度為0.5 mmol/L時對甘露糖酶具有激活作用，但在濃度為1.0 mmol/L時表現(xiàn)為抑制作用。 以上研究表明：以蘋果渣與棉粕代替麩皮、豆粕、淀粉等常規(guī)原料作為果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶等NSP酶的生產(chǎn)原料在技術(shù)上具有可行性，在產(chǎn)生多種水解酶類、提高蛋白質(zhì)