菠蘿蛋白酶酶解海灣扇貝裙邊制備抗氧化肽的研究.pdf

1、我國海域遼闊，是水產(chǎn)品養(yǎng)殖和消費大國。扇貝是重要的水產(chǎn)品種類，以其營養(yǎng)價值高且味道鮮美的特點深受消費者的喜愛，具有廣闊的市場空間。其中河北省的海灣扇貝養(yǎng)殖與加工產(chǎn)業(yè)大部分分布在環(huán)渤海地區(qū)，每年產(chǎn)量可觀。但在加工過程中由于企業(yè)深加工及綜合利用技術落后導致了扇貝加工副產(chǎn)物裙邊利用率低，大部分被直接放棄，造成資源的嚴重浪費和環(huán)境污染。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)扇貝裙邊富含蛋白質(zhì)，可用作蛋白類產(chǎn)品的原料。
　　針對扇貝加工下腳料加工工藝簡單、利用程度低等

2、產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題，本研究以扇貝加工副產(chǎn)物扇貝裙邊為研究對象，利用扇貝裙邊制備生物活性肽，通過酶工程制備技術以及超濾、SephadexG-25、HPLC等一系列純化技術分離具有生物活性的抗氧化肽，以期為扇貝裙邊的綜合深加工利用提供理論與技術支持。本研究的主要實驗內(nèi)容與結果如下:
　　1.菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。本研究以DPPH清除率即抗氧化活性為選擇指標，得到了酶解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。首先進行了五

3、個單因素試驗，根據(jù)單因素的試驗結果從五個單因素即溫度、pH值、底物濃度、加酶量和時間中選擇出溫度、pH值和底物濃度三個對酶解效果有顯著性影響的因素對扇貝裙邊酶解工藝進行響應面優(yōu)化，并且以抗氧化活性作為考察指標，得到的最佳酶解條件為反應溫度68.37℃，pH9.35，底物濃度6.25％，加酶量6000 U/g，反應時間6h。在此最優(yōu)酶解條件下測定DPPH的清除率達到70.32％。
　　2.扇貝裙邊抗氧化肽的分離純化研究。經(jīng)過酶解得到

4、的酶解液中通常含有多種雜質(zhì)，比如未酶解的扇貝裙邊、變性的蛋白酶等。因此需要對酶解產(chǎn)物進行分離純化以獲得目標抗氧化肽。第一步利用超濾法分離純化扇貝抗氧化肽。采用對酶解液具有不同分離效果的10 kDa、5 kDa、3kDa、1 kDa的四種規(guī)格的超濾膜對扇貝裙邊酶解產(chǎn)物進行初步分離，獲得SSPH-Ⅰ(＜1 kDa)、SSPH-Ⅱ(1 kDa～3 kDa)、SSPH-Ⅲ(3 kDa～5 kDa)、SSPH-Ⅳ(5kDa～10 kDa)、SSP

5、H-Ⅴ(＞10 kDa)和SSPH-Ⅵ（酶解原液）六種不同分子量組分。冷凍干燥后利用清除DPPH自由基和清除羥自由基兩種方法評價比較以上六種組分的抗氧化性，得到具有最強抗氧化活性的組分是SSPH-Ⅱ(1kDa～3 kDa)，當該組分濃度為32 mg/ml時，其DPPH清除率達到94.16％，羥自由基清除率達到31.20％。
　　第二步采用Sephadex G-25凝膠色譜層析方法對組分SSPH-Ⅱ進行純化。為得到較好的分離效果本試

6、驗對凝膠層析條件進行了優(yōu)化，得到在洗脫速度為1.0 mL/min，上樣量為0.25mL，上樣濃度為50 mg/mL的條件下，層析分離效果最好。在最佳的層析條件下從SSPH-Ⅱ分離純化出兩個組分即SSPH-Ⅱ-F1和SSPH-Ⅱ-F2。采用DPPH自由基清除方法測定SSPH-Ⅱ-F1和SSPH-Ⅱ-F2兩個組分抗氧化性后發(fā)現(xiàn)SSPH-Ⅱ-F1抗氧化性高于SSPH-Ⅱ-F2，當兩個組分的濃度均為32mg/mL時，SSPH-Ⅱ-F1的DPPH

7、自由基清除率為34.10％，SSPH-Ⅱ-F2的DPPH自由基清除率為16.85％。
　　第三步利用反相高效液相色潽法（RP-HPLC）進一步分離純化SSPH-Ⅱ-F1。在如下色譜條件下，色譜柱Syncronis aQ（250 mm×4.6 mm，5μm）;柱溫:30℃;流速:0.6 mL/min;進樣量:20μL;流動相:10％乙腈(0.05％ TFA)檢測波長為280nm。SSPH-Ⅱ-F1經(jīng)分離純化后得到系列峰SSPH-Ⅱ-