動(dòng)物膽堿酯酶的制備及其在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、本論文利用膽堿酯酶活性可被有機(jī)磷農(nóng)藥所抑制的毒理機(jī)制，采用酶抑制分光光法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)。針對(duì)目前這種快速檢測(cè)方法所使用的膽堿酯酶尚無標(biāo)準(zhǔn)的制劑且不同來源的酶制劑酶活性差別大，影響檢測(cè)效果的問題，以不同來源的動(dòng)物膽堿酯酶為試材，通過對(duì)膽堿酯酶的活性和耐藏性的比較及其它特性的綜合分析，篩選出來源充足、酶活高、耐保藏的酶源；針對(duì)酶抑制分光光度法使用的膽堿酯酶的純度直接決定檢測(cè)效果，試驗(yàn)將篩選出的動(dòng)物膽堿酯酶進(jìn)行分離純化，

2、提純出一種靈敏度及純度高的膽堿酯酶；通過對(duì)不同處理的膽堿酯酶耐藏性的比較和保存方法的篩選研究，確定膽堿酯酶制劑的適宜制備方法；通過對(duì)膽堿酯酶包裝材料的篩選研究，確定適宜的酶制劑的包裝材料。具體膽堿酯酶的分離純化步驟：粗酶液經(jīng)硫酸銨飽和溶液鹽析后透析，再經(jīng)DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析。研究結(jié)果表明，不同動(dòng)物來源的膽堿酯酶酶活力存在差異，馬血清中的膽堿酯酶的酶活力明顯高于其它動(dòng)物來源的酶活力，綜合考慮

3、不同酶源的酶活、來源充足性、取材方便性、保藏性等因素，篩選出馬血清作為適宜酶源。通過對(duì)純化后的膽堿酯酶性質(zhì)研究得出酶的適宜反應(yīng)溫度為35℃，適宜pH值為7.5，對(duì)底物氯化乙酰膽堿的K<,m>值為0.192mmol/L，適宜底物濃度為4mmol/L，高濃度底物對(duì)酶有抑制作用，該酶對(duì)熱不穩(wěn)定。敵敵畏、敵百蟲和辛硫磷對(duì)膽堿酯酶的抑制中濃度分別為0.061mg/kg、0.260mg/kg、0.204mg/kg；真空冷凍干燥法制作酶粉制劑效果較佳

4、，酶制劑采用硫酸紙包裝，在-20～25℃條件下保存。 將本試驗(yàn)所制備的膽堿酯酶制劑應(yīng)用到蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，并對(duì)酶抑制分光光度法快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)條件進(jìn)行了篩選研究，利用該方法進(jìn)行了市場(chǎng)抽樣檢測(cè)，結(jié)果表明，提取純化的馬血清膽堿酯酶制劑可用于蔬菜中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定，檢測(cè)限可達(dá)0.023mg/kg，可以滿足國(guó)家規(guī)定的蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求；通過正交試驗(yàn)確定檢測(cè)敵敵畏的適宜條件為：抑制時(shí)間15min

5、，抑制溫度35℃，底物用量0.1mL，酶液用量0.1mL；檢測(cè)敵百蟲的適宜條件為：抑制時(shí)間20min，抑制溫度35℃，底物用量0.1mL，酶液用量0.1mL；檢測(cè)辛硫磷的適宜條件為抑制時(shí)間20min，抑制溫度35℃，底物用量0.1mL，酶液用量0.1mL，以敵百蟲和辛硫磷為抑制劑其抑制效果不如敵敵畏的好，在檢測(cè)敵百蟲和辛硫磷農(nóng)藥殘留時(shí)可將抑制時(shí)間適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)。在市場(chǎng)抽樣調(diào)查幾種蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留狀況中，小白菜和黃瓜的污染狀況較為嚴(yán)重，生菜