中鏈脂肪酸對小鼠膽固醇代謝的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.探索并證實中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acids,MCFAs)具有改善高膽固醇飼料誘導(dǎo)的高膽固醇血癥小鼠膽固醇代謝的作用。
　　2.探討中鏈脂肪酸(辛酸和癸酸)上述作用的可能機(jī)制,證實其具有促進(jìn)糞中性固醇和糞膽汁酸排泄作用。
　　3.探討中鏈脂肪酸(辛酸和癸酸)促進(jìn)糞中性固醇和糞膽汁酸排泄可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.C57BL/6J小鼠高膽固醇血癥模型的建立<

2、br>　　4周齡雄性C57BL/6J小鼠102只,用普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)挑選出10只小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料(AIN-96G),設(shè)為對照組(Control),余92只小鼠喂飼富含膽固醇飼料(CR組),飼料含蛋白19.07％、脂肪13.63%、碳水化合物48.18%、膽固醇1%和膽鹽0.3%。喂養(yǎng)2周后,禁食不禁水12h,頜下靜脈采血0.2mL,測定血清總膽固醇(total cholesterol,TC)和總膽汁酸(total bil

3、eacids,TBA)含量。
　　2.MCFAs對C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用
　　采用前述高膽固醇血癥模型小鼠按照空腹血清TC水平和空腹體重隨機(jī)分6組(每組9只),分別采用含2%的辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、油酸(C18:1)、α-亞麻酸(C18:3)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的富含膽固醇飼料喂養(yǎng)12周,期間記錄飼料消耗量和小鼠體重。在實驗6周頜下靜脈采血0.2mL檢測血

4、TC、TBA、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)水平;實驗12周麻醉后處死小鼠,腹主動脈取血,檢測血TC、TBA、LDL-c、HDL-c、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)和載脂蛋白A1(apolipoprotein A1,

5、apo-A1)水平,解剖分離肝臟和附睪周圍白色脂肪組織,取出后用生理鹽水洗凈吸干后稱重,肝組織勻漿后檢測甘油三酯(triacylglycerol,TG)、TC、磷脂(phospholipid,PL)、LDL-c和HDL-c水平。
　　3.MCFAs促進(jìn)C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠糞便內(nèi)中性固醇和膽汁酸排泄的研究
　　按上述方法喂養(yǎng)小鼠,各組中隨機(jī)取5只小鼠,分別在實驗開始前和實驗結(jié)束前放入代謝籠,單籠喂養(yǎng)3天,收集并記錄

6、各自飼料消耗和糞便排出量。收集后的糞便冷凍干燥后稱重、粉碎,分別用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測糞便內(nèi)中性固醇和膽汁酸含量,并計算其3天的總排出量。
　　4.MCFAs調(diào)節(jié)C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠肝臟膽固醇代謝的機(jī)制研究
　　按上述方法喂養(yǎng)小鼠,實驗12周結(jié)束后,處死小鼠取肝臟組織,分別用Real-time RT-PCR法和Western blotting法檢測其中的羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(hydrox

7、ymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CR)、膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、肝X受體(liver X receptor,LXR)和法尼酯受體(farnesoid X receptor,FXR)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平情況。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6J小鼠高膽固醇血癥模型的建立高膽固醇飼料喂養(yǎng)2周后,CR組(9

8、2只)小鼠空腹血清TC水平基本呈正態(tài)分布,其TC水平高于對照組2個標(biāo)準(zhǔn)差(2SD)以上的小鼠共64只,峰值集中分布在2.78mmol/L到4.22mmol/L之間,即高于對照組均值(2.3mmol/L)的2SD到8SD之間,共計58只,占全部CR組的63%,高膽固醇血癥小鼠模型建立成功。
　　2.MCFAs對C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠血脂及膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用
　　1)實驗結(jié)束(12周)時:C8:0、C10:0和C18

9、:3組小鼠的空腹體重和肝臟組織重均顯著低于C16:0組(P<0.05)和C18:0組(P<0.01);C8:0、C10:0、C18:1、C16:0和C18:3組小鼠BMI、Lee’s指數(shù)均顯著低于C18:0組(P<0.05)。
　　2)實驗結(jié)束(12周)時:C8:0組(P<0.01)、C10:0組(P<0.05)及C18:3組(P<0.01)的血清TC水平顯著低于C16:0組;C8:0、C10:0和C18:3組的血清LDL-c水平

10、顯著低于C16:0組(P<0.05);C8:0、C10:0及C18:3組的HDL-c/LDL-c比值顯著高于C18:1、C16:0及C18:0組;C8:0組(P<0.05)、C10:0組(P<0.01)、C18:1組(P<0.05)及C18:3組(P<0.05)血清TG水平顯著低于C16:0組;C8:0組(P<0.05)血清HDL水平顯著高于C18:1組、C16:0組和C18:0組。
　　3)實驗結(jié)束(12周)時:各組間肝臟組織中

11、的TC、LDL-c、HDL-c、TG和LP水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。
　　3.MCFAs促進(jìn)C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠糞便內(nèi)中性固醇和膽汁酸排泄的研究
　　1)小鼠糞便中的膽固醇是糞便中性固醇的主要排出形式,約占97%;膽酸(cholic acid,CA)是糞便總膽汁酸的主要排出形式,占75%以上。
　　2)研究結(jié)束時,C8:0組(P<0.05)小鼠糞便中的膽固醇排出量及中性固醇總排出量均顯著高于C16:

12、0組和C18:0組;C8:0組小鼠糞便中的二氫膽固醇排出量顯著高于C16:0組(P<0.05)。
　　3)研究結(jié)束時,糞便中游離膽汁酸(unconjugated bile acids,UCBAs)排泄情況如下:
　?、貱8:0組(P<0.05)的熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)和石膽酸(lithocholic acid,LCA)排泄量顯著高于C16:0組和C18:0組,CA及總UCBAs的排泄

13、量顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.05),并且結(jié)束時CA排泄量顯著高于自身在實驗開始的排泄量(P<0.01);
　?、贑10:0組(P<0.05)的CA排泄量顯著高于C18:0和C18:1組,而總UCBAs的排泄量顯著高于C16:0和C18:0組;
　?、跜18:1組(P<0.05)的LCA排泄量顯著高于C16:0和C18:0組;
　?、蹸18:3組(P<0.05)的UDCA排泄量顯著高于C16:

14、0和C18:0組,而CA及總UCBA的排泄量顯著高于C18:0組。
　　4)研究結(jié)束時,糞便中?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸(taurine conjugated bile acids,TCBAs)排泄情況如下:
　　①C8:0組(P<0.05)的?；敲撗跄懰?taurodeoxycholic acid,TDCA)排泄量顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組,?；蛆Z脫氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid,T

15、CDCA)及總TCBAs的排泄量顯著高于C18:0組;
　　②C10:0組(P<0.05)的TDCA排泄量顯著高于C18:0組,TCDCA及總TCBAs的排泄量顯著高于C16:0和C18:0組;
　?、跜18:1組(P<0.05)的TDCA排泄量顯著低于C16:0組,TCDCA排泄量顯著高于C16:0和C18:0組,總TCBAs的排泄量顯著高于C18:0組;
　?、蹸18:3組(P<0.05)的TCDCA和TDCA排泄

16、量都顯著高于C18:0組。
　　5)研究結(jié)束時,糞便中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸(glycine conjugated bile acids,GCBAs)排泄情況如下:C18:1組(P<0.05)小鼠糞便中甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)及總GCBAs排泄量顯著高于其他各組。
　　6)實驗結(jié)束時:
　?、侔凑漳懼岷铣山?jīng)典途徑中的CA及其與氨基酸結(jié)合系列產(chǎn)物統(tǒng)計,C8:0和C1

17、0:0組的排泄量顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.01);其中C8:0組還顯著高于C18:3組(P<0.05)。
　　②按照膽汁酸合成經(jīng)典途徑中的脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)及其與氨基酸結(jié)合系列產(chǎn)物統(tǒng)計,C8:0組顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.01),并顯著高于C18:3組(P<0.05);C10:0組顯著高于C18:0和C18:1組(P<0.01)。
　　

18、③按照只由經(jīng)典合成途徑生成的膽汁酸總排泄量統(tǒng)計,C8:0和C10:0組均顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.01),其中C8:0組還顯著高于C18:3組(P<0.05)。
　　7)實驗結(jié)束時:
　　①按照膽汁酸合成替代途徑中的鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)及其與氨基酸結(jié)合系列產(chǎn)物統(tǒng)計,C10:0組的排泄量顯著高于C16:0、C18:0和C18:3組(P<0.01),C8:

19、0組顯著高于C18:0組(P<0.05)。
　　②按照膽汁酸合成替代途徑中的LCA及其與氨基酸結(jié)合系列產(chǎn)物統(tǒng)計,C8:0組顯著高于C16:0和C18:0組(P<0.01);C10:0組顯著高于C16:0和C18:0組(P<0.05)。
　　③按照只可由替代合成途徑生成的膽汁酸總排泄量進(jìn)行統(tǒng)計,C8:0和C10:0組均顯著高于C16:0和C18:0組(P<0.01),其中C10:0組還顯著高于C18:3組(P<0.05)。

20、r>　　8)實驗結(jié)束時:總初級膽汁酸排泄量比較發(fā)現(xiàn)C8:0和C10:0組均顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.01),其中C8:0組還顯著高于C18:3組(P<0.05);總次級膽汁酸排泄量比較發(fā)現(xiàn)C8:0組顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.01),以及顯著高于C18:3組(P<0.05),而C10:0組顯著高于C16:0組(P<0.05)和C18:0組(P<0.01)。
　　9)C8:0和C

21、10:0組糞便中總膽汁酸排泄量均顯著高于C16:0、C18:0和C18:1組(P<0.05),并且C18:3組也顯著高于C18:0組(P<0.05)。
　　4.MCFAs調(diào)節(jié)C57BL/6J高膽固醇血癥小鼠肝臟膽固醇代謝的機(jī)制研究
　　1)實驗結(jié)束時,各組小鼠肝臟組織中HMG-CR的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均無顯著差異(P>0.05)。
　　2)實驗結(jié)束時,C8:0和C10:0組小鼠肝組織中的CYP7A1的mRNA轉(zhuǎn)

22、錄和蛋白表達(dá)水平均顯著高于C16:0和C18:0組(P<0.05);C18:1和C18:3組小鼠肝組織中的CYP7A1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于C18:0組(P<0.05)。
　　3)實驗結(jié)束時,C8:0組小鼠肝組織中LXR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于C18:0組(P<0.05),蛋白表達(dá)水平顯著高于C18:1和C18:3組(P<0.01);C10:0組小鼠肝組織中的LXR的mRNA轉(zhuǎn)錄(P<0.05)和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)

23、顯著高于C16:0和C18:0組。C18:3組肝組織中LXR的蛋白表達(dá)水平顯著高于C16:0和C18:0組(P<0.01)。
　　4)實驗結(jié)束時,各組小鼠肝臟組織中FXR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均無顯著差異(P>0.05);C8:0和C10:0組的FXR的蛋白表達(dá)水平顯著低于C16:0和C18:0組(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.給予雄性C57BL/6J小鼠富含膽固醇飼料(脂肪占13.63%,蛋白質(zhì)占19.07%,碳

24、水化合物占48.18%,膽固醇占1%,膽鹽占0.3%)喂養(yǎng)2周后,可誘導(dǎo)60%的小鼠空腹血清膽固醇水平顯著升高,此方法復(fù)制的高膽固醇血癥小鼠模型可作為后續(xù)研究的動物模型。
　　2.長期給予MCFAs飼料喂養(yǎng)12周后,與LCFAs相比,MCFAs可顯著降低高膽固醇血癥小鼠體重、Lee’s指數(shù)、BMI和肝臟組織重,改善血清TG、TC、LDL-c和HDL-c水平,但并不影響肝臟脂蛋白水平。
　　3.MCFAs改善血清TG、TC、L

25、DL-c和HDL-c水平主要途徑之一是促進(jìn)了糞便中膽固醇和膽汁酸的排泄,其中辛酸主要通過促進(jìn)糞膽固醇和糞膽酸排泄從而降低血清TC和LDL-c水平;癸酸主要通過促進(jìn)糞便中糞膽酸排泄從而降低血清TC和LDL-c水平。
　　4.MCFAs通過上調(diào)肝臟組織中LXR的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,同時下調(diào)FXR的蛋白表達(dá)水平,從而上調(diào)CYP7A1酶的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了糞便的中性固醇和膽汁酸的排泄;同時并不影響肝臟組織中的HMG-CR酶的轉(zhuǎn)錄和