γ-聚谷氨酸的異源表達及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、聚-γ-谷氨酸是一種由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體通過γ-羧基與α-氨基形成的肽鍵縮合而成的一種聚陰離子類多肽分子.其分子量一般在100～1000kDa之間,相當于500～5000個左右的谷氨酸單體.作為一種生物高分子材料,γ-PGA具有生物可降解性好、可食、對人體和環(huán)境無毒害的優(yōu)點.目前已經(jīng)確定編碼γ-PGA合成酶系的全部基因(pgsB、pgsC、pgsA). 本論文以大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌為宿主進行γ-PGA的異源表達研究.

2、從Bacillus subtilis ZJU-7中克隆得到了pgsB、pgsC、pgsA三個基因,采用了 pTrc99a和pXMJ19兩種質(zhì)粒作為載體,分別構(gòu)建了pTrc99a-pgsBCA和 pXMJ19-pgsBCA兩個重組表達質(zhì)粒.選取E.coli JM109、E.cold BL21、 Corynebacterium glutamicum RES167為宿主, 分別構(gòu)建了E.coli JM109/pTrc99a-pgsBCA、E.

3、coli BL21/ pXMJ19-pgsBCA、Corynebacterium glutamicum RES 167/pTrc99a-pgsBCA 、Corynebacterium glutamicumRES167/pXMJ19-pgsBCA共4個重組菌株.并且對各個重組菌株的γ-PGA合成能力進行了鑒定.其中E.coli JM109/pTrc99a-pgsBCA、 E.coli BL21/ pXMJ19-pgsBCA、Coryneb

4、acterium glutamicum RES167/pXMJ19-pgsBCA具備了γ-PGA的合成能力.并且對E.coli BL21/pXMJ19-pgsBCA的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化.得到了以下的培養(yǎng)基成分:蔗糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,L-谷氨酸10 g/L,NaC110gm,lmM MnSO<,4>,氯霉素34μg/ml,IPTG lmM.使用以上的培養(yǎng)基配方,γ-PGA的產(chǎn)量達到了1.17 g/L. 對本實驗室保

5、藏的一株聚-γ-谷氨酸高產(chǎn)菌株(Bacillus subfilis ZJU-7)進行了復(fù)壯,從中篩選出一株相對高產(chǎn)的菌株,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到48 g/L.并且對Bacillus subtilis ZJU-7進行了搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化.在此基礎(chǔ)上,在15L發(fā)酵罐上對發(fā)酵過程進行了初步的放大研究,γ-PGA產(chǎn)量達到了23 g/L.針對Bacillussubtilis ZJU-7發(fā)酵過程中需要添加大量的蛋白胨引起發(fā)酵成本過高的問題,進行了Bacil