HIV-1NC蛋白的表達(dá)純化及免疫原性的初步研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的核殼體蛋白(NC)含有兩個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC型)，而它又在HIV-1生活周期的多個階段多個步驟中都起到非常關(guān)鍵的作用，因此核殼體蛋白成為近年來抗HIV藥物研究的熱點之一，但是出于HIV高度的遺傳變異性和抗HIV藥物的高毒副作用及高昂的價格，HIV口服疫苗在控制HIV感染和艾滋病流行中的重要生物醫(yī)學(xué)干預(yù)作用便由此凸顯出來。
　　 本實驗課題是從pNL4-3質(zhì)粒經(jīng)PCR得到HIV-1 N

2、C的編碼序列，然后克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點中，成功構(gòu)建了重組pET-28a(+)原核表達(dá)載體。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)Westernblotting鑒定成功表達(dá)后，裂解菌體，進行純化。重組蛋白存在于上清中，首先采用Ni柱親和層析初步純化，超濾濃縮后通過凝膠過濾層析進一步純化，收集并濃縮重組蛋白，免疫新西蘭雄兔，自制多克隆抗體并利用抗原親和層析純化多克隆抗體。

3、另一方面，首先利用桿狀病毒載體pFastBacl作為供體質(zhì)粒，將HIV-1NC的編碼序列轉(zhuǎn)座到Bacmid上，構(gòu)建重組Bacmid-nc。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞得到重組病毒后，通過熒光定量PCR測定了重組病毒的滴度，用擴增后的重組病毒感染家蠶細(xì)胞，以自制并純化的多克隆抗體為一抗，Western blotting鑒定目的蛋白NC在家蠶細(xì)胞中已成功表達(dá)，并自制抗體親和純化柱從細(xì)胞中進行了目的蛋白的純化。最后，用重組病毒分別大量接種家蠶五齡

4、幼蟲和蛹，Westernblotting鑒定NC在家蠶幼蟲及蛹中也得到成功的表達(dá)。
　　 發(fā)病蠶蛹和正常蠶蛹分別經(jīng)勻漿、過濾、離心、超濾、凍干后，研究小鼠口服免疫效果。實驗組包括原核免疫組(原核表達(dá)的重組蛋白+正常蠶蛹粉)和真核免疫組(表達(dá)NC的發(fā)病蠶蛹粉)，對照組包括0.9％生理鹽水組和正常蠶蛹粉組。最終用間接ELISA檢測小鼠血清抗NC特異性抗體的反應(yīng)情況。
　　 本研究在利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)HIV-1