大鼠嗅球神經(jīng)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立新生大鼠嗅球神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)體外分離培養(yǎng)方法。通過對不同發(fā)育階段大鼠嗅球NSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果分析，探討不同發(fā)育階段大鼠嗅球NSCs增殖、分化特性。使用不同濃度的胎牛血清、IGF-Ⅰ和BDNF誘導(dǎo)大鼠嗅球NSCs的分化，探討促進(jìn)大鼠嗅球NSCs向神經(jīng)元分化的因素，為大鼠嗅球NSCs的深入研究與臨床應(yīng)用打基礎(chǔ)。 材料與方法：從新生大鼠嗅球組織中分離NSCs

2、，采用神經(jīng)細(xì)胞球形成法，以無血清培養(yǎng)液，使用生長因子(bFGF、EGF)，進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，以機(jī)械分離法連續(xù)傳代，相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Nestin表達(dá)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法和流式細(xì)胞儀檢測大鼠嗅球NSCs的增殖能力。取胎齡18天(embryonicday18,ED18)、出生24h以內(nèi)(postnatalwithin24h,P0)及2月齡(2month,M2)的大鼠嗅球組織行單細(xì)胞克隆，免疫熒

3、光化學(xué)染色鑒定嗅球NSCs，并計(jì)數(shù)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞法觀察不同濃度的胎牛血清、IGF-Ⅰ和(或)BDNF對嗅球NSCs分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響。 結(jié)果：光鏡下原代培養(yǎng)見細(xì)胞呈大小不一、懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)，邊界清晰，折光性好，細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞排列較為致密，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)與原代培養(yǎng)無明顯差異，電鏡下嗅球NSCs呈原始細(xì)胞的形態(tài)特征，嗅球NSC

4、s在含有生長因子bFGF和EGF的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，能形成大量懸浮的神經(jīng)球，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，Nestin抗體標(biāo)記陽性，MTT比色法和流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明這些干細(xì)胞球可在體外擴(kuò)增及傳代培養(yǎng)。在相同培養(yǎng)條件下，原代培養(yǎng)6h時(shí)，各組細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)無明顯區(qū)別，7d后，ED18組和P0組懸浮神經(jīng)球數(shù)目無顯著差異，M2組懸浮神經(jīng)球較少，免疫熒光染色結(jié)果顯示：ED18和P0段大鼠嗅球NSCs與M2段在增殖、分化特性上存在著明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

5、顯示：隨著發(fā)育階段的增長，形成神經(jīng)球的細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢減少，但對于星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響。在無血清培養(yǎng)液中，嗅球NSCs大多數(shù)分化為神經(jīng)元，而在有血清培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加，且星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量隨血清含量的增多而增多，IGF-Ⅰ+BDNF組NSCs分化最快、最完全，無血清對照組細(xì)胞貼壁及分化最慢，IGF-Ⅰ組和IGF-Ⅰ+BDNF組NSE染色陽性細(xì)胞均多于無血清對照組，而GFAP染色陽性細(xì)胞數(shù)少

6、于無血清對照組(P＜0.05)，CNP陽性細(xì)胞數(shù)各組間差異無顯著性。 結(jié)論：新生大鼠嗅球可以培養(yǎng)出具有自我增殖和多向分化潛能的NSCs。不同發(fā)育階段的大鼠嗅球內(nèi)均存在著NSCs，它們在體外擴(kuò)增、傳代，自然分化后表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，嗅球NSCs增殖分化特性在不同發(fā)育階段存在一定的差異，隨著發(fā)育階段的增長，形成神經(jīng)球的細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢減少。胎牛血清有助于嗅球NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分