腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的初步分析.pdf

1、第一部分腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織樣本隊(duì)列的構(gòu)建
　　 目的：探索腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織樣本隊(duì)列模型的構(gòu)建，明確組織性質(zhì)
　　 方法：志愿捐獻(xiàn)術(shù)后手術(shù)標(biāo)本病例共9人，年齡從47歲至64歲不等。術(shù)前均根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果及臨床診斷為腎透明細(xì)胞癌。9例病患都選擇進(jìn)行腎根治性切除手術(shù)方式治療，其中術(shù)前T1aN0M04例(44.4％)，T1bN0M05例(55.6％)；男性6例(66.7％)，女性3例(33.3％)；年齡分布為

2、55.2±7.1歲。分別選取9例病例術(shù)后切除標(biāo)本中連續(xù)取材腎癌假包膜內(nèi)組織2枚(0.5cm直徑)，連續(xù)取材假包膜2cm外腎臟組織2枚(0.5cm直徑)。對(duì)假包膜內(nèi)、外各1枚組織進(jìn)行4％甲醛溶液脫水、石蠟包埋固定，并以HE染色、Cytokeratin，pan染色以及Vimentin染色明確細(xì)胞學(xué)形態(tài)以及標(biāo)志物表達(dá)情況；對(duì)假包膜內(nèi)、外各另1枚組織進(jìn)行快速冰凍處理，后用RNA TRIzol試劑盒進(jìn)行RNA提取。
　　 結(jié)果：志愿捐獻(xiàn)術(shù)

3、后手術(shù)標(biāo)本病例共9人，年齡從47歲至64歲不等。術(shù)前均根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果及臨床診斷為腎透明細(xì)胞癌。9例病患都進(jìn)行腎根治性切除手術(shù)方式治療男性6例(66.7％)，女性3例(33.3％)；年齡分布為55.2±7.1歲。
　　 1)根據(jù)術(shù)后大體標(biāo)本及腎門淋巴結(jié)病理結(jié)果：腎腫瘤分期與術(shù)前一致，T1aN0M04例(44.4％)，T1bN0M05例(55.6％)。
　　 2)H.E染色分析：從細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，第6例入組病患為腎嫌色細(xì)

4、胞癌，其余8例病例均為腎透明細(xì)胞癌；腎包膜外腎臟組織無(wú)腫瘤組織侵犯，為正常腎臟組織。
　　 3)免疫組織化學(xué)分析：Vimentin染色提示第6例入組病患標(biāo)記為陰性，其余8例病例均為陽(yáng)性；腎包膜外腎臟組織均提示染色陰性。
　　 4)抽提RNA質(zhì)量由電泳明確，RNA提取濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　 結(jié)論：樣本中出現(xiàn)少發(fā)腫瘤并非是我們所能控制的，但術(shù)后病理提示的腎細(xì)胞癌分期與術(shù)前完全一致?？焖俦鶅龇▽?duì)于腎透明細(xì)胞癌組織及假

5、包膜外腎臟組織提取，能夠很好的避免RNA降解的問(wèn)題。
　　 第二部分 RNA-seq技術(shù)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組織內(nèi)基因表達(dá)水平變化
　　 目的：應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)腎透明細(xì)胞癌組織轉(zhuǎn)錄物組進(jìn)行完全測(cè)序，從而從轉(zhuǎn)錄物水平驗(yàn)證已知與腎透明細(xì)胞癌的相關(guān)基因、基因組合或通路；尋找潛在可能的影響腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤進(jìn)展的潛在基因組合、通路。
　　 方法：自第一部分試驗(yàn)中提取的9例病例的腫瘤組織及瘤旁組織的RN

6、A樣本，進(jìn)行cDNA第一鏈合成，添加測(cè)序接頭，按照PCR程序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后，應(yīng)用Illumina HiSeq2000測(cè)序。測(cè)序后所獲得的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平數(shù)據(jù)結(jié)合UCSC GenomeBrowser與MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。而后結(jié)合應(yīng)用Blat(Blast-likealignment tool，Blat)、Bowtie、RUM(RNA-Seq unified mapper，RUM)、DEseq、GSEA(Gene Set E

7、nrichment Analysis，GSEA)等基因分析軟件，在染色體、基因組合、基因通路等多種水平分析RNA-seq所獲得的數(shù)據(jù)，從而對(duì)已知的相關(guān)基因、基因組合或通路的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，或發(fā)現(xiàn)一些表達(dá)水平存在差異的基因組合或通路。
　　 結(jié)果：根據(jù)9例RNA提取樣本RNA-seq轉(zhuǎn)錄組水平檢測(cè)的結(jié)果，歸一化處理后，結(jié)合多種基因分析軟件，獲得以下結(jié)果：
　　 1)通過(guò)應(yīng)用RNA-seq技術(shù)所進(jìn)行的全基因組水平的轉(zhuǎn)錄組分

8、析，驗(yàn)證腎透明細(xì)胞癌已知的異?；虮磉_(dá)如EGLN3、CA9及VEGFA等，同時(shí)第6例腫瘤樣本中所獨(dú)特的基因表達(dá)，也與第一部分HE染色及免疫組化的結(jié)果一致。
　　 2)通過(guò)本研究，驗(yàn)證了現(xiàn)有與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)的VHL/HIF通路，同時(shí)在染色體水平上也驗(yàn)證了染色體3p區(qū)域的表達(dá)缺失與染色體5q區(qū)域的表達(dá)上調(diào)。而第6例樣本在染色體1號(hào)、2號(hào)及17號(hào)區(qū)域上的表達(dá)缺失，在染色體3號(hào)與7號(hào)區(qū)域上的表達(dá)上調(diào)都提示我們這是腎嫌色細(xì)胞癌的

9、特征，與第一部分的觀察結(jié)果一致。
　　 3)本研究更通過(guò)對(duì)RNA-seq的表達(dá)異常基因的集合分析，尋找到35個(gè)值得關(guān)注的基因組合，驗(yàn)證了與VHL/HIF通路有關(guān)的基因組合在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)差異，以及有關(guān)腎功能的基因組合在癌組織中的表達(dá)缺失，并且在染色質(zhì)修飾的相關(guān)基因研究中驗(yàn)證了最近有關(guān)PBRM1的外顯子測(cè)序結(jié)果。
　　 4)通過(guò)與NCBI芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GSE17895與GSE11024中的比對(duì)，本研究發(fā)現(xiàn)了RUNX1

10、-RUNX1T1通路相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌組織中的特異性表達(dá)上升。
　　 結(jié)論：我們應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)9對(duì)腎細(xì)胞癌以及癌旁組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平的全基因組測(cè)序，RNA-seq技術(shù)的全數(shù)字化信號(hào)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)得到充分發(fā)揮，有效的驗(yàn)證了現(xiàn)已知的腎透明細(xì)胞癌在相關(guān)基因、基因組合以及染色體水平上的特異性表達(dá)，并且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病存在相關(guān)性的RUNX1-RUNX1T1通路。
　　 第三部分 RUNX1-RUNX

11、1T1通路的初步驗(yàn)證
　　 目的：驗(yàn)證RUNX1-RUNX1T1通路在腎透明細(xì)胞癌組織中與癌旁組織中表達(dá)水平的差異
　　 方法：選取2010年收治于我科的志愿捐獻(xiàn)術(shù)后手術(shù)標(biāo)本病例共4人，年齡從49歲至58歲不等。術(shù)前均根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果及臨床診斷為腎透明細(xì)胞癌。4例病患都選擇進(jìn)行腎根治性切除手術(shù)方式治療，其中術(shù)前T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)；男性3例(75％)，女性1例(25％)；年齡分布為

12、55.2±7.1歲。分別選取4例病例術(shù)后切除標(biāo)本中連續(xù)取材腎癌假包膜內(nèi)組織2枚(0.5cm直徑)，連續(xù)取材假包膜2cm外腎臟組織2枚(0.5cm直徑)。對(duì)假包膜內(nèi)、外各1枚組織進(jìn)行4％甲醛溶液脫水、石蠟包埋固定，并以HE染色、Cytokeratin，pan染色以及Vimentin染色明確細(xì)胞學(xué)形態(tài)以及標(biāo)志物表達(dá)情況；對(duì)假包膜內(nèi)、外各另1枚組織進(jìn)行快速冰凍處理，后用RNA TRIzol試劑盒進(jìn)行RNA提取。選取RUX1-RUNX1T1通路

13、中的NETO2、GBP2及VCAN基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果：手術(shù)標(biāo)本病例共4人，年齡從49歲至58歲不等。術(shù)前均根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果及臨床診斷為腎透明細(xì)胞癌。4例病患都選擇進(jìn)行腎根治性切除手術(shù)方式治療，其中術(shù)前T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)；男性3例(75％)，女性1例(25％)；年齡分布為53.8±3.3歲。
　　 1)根據(jù)術(shù)后大體標(biāo)本及腎門淋巴結(jié)病理結(jié)果：腎腫瘤分期與術(shù)前一致

14、，T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)。
　　 2)H.E染色分析：從細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析選取所有4例患者均為腎透明細(xì)胞癌。
　　 3)免疫組織化學(xué)分析：Cytokeratin，pan染色與Vimentin染色提示所有4例腫瘤組織染色均為陽(yáng)性。
　　 4)抽提RNA質(zhì)量由電泳明確，RNA提取濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　 5)在4例腎透明細(xì)胞癌病例的qRT-PCR，NETO2、GBP2及VCAN