抑制脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2改善載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究.pdf

1、第一部分:慢病毒介導(dǎo)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2RNA干擾抑制RAW264.7細胞炎癥基因表達的實驗研究
　　研究背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個復(fù)雜的多因素過程并與炎癥密切相關(guān)。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2,Lp-PLA2)是一個新型的AS危險因子和標(biāo)志物，并可對斑塊不穩(wěn)定、破裂及未來的心血管事件起到預(yù)測作用。Lp-PLA2可以

2、通過水解氧化磷脂并生成具有強大生物學(xué)活性的溶血磷脂膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)和氧化非酯化脂肪酸(oxidizednon-esterifiedfattyacid，oxNEFA)，它們都在AS的形成及進展過程中起關(guān)鍵作用。抑制炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)可以在臨床上高效特異性地降低目標(biāo)基因的表達。在本研究中，我們采用RNA干擾的方法來降低

3、小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7細胞)Lp-PLA2的表達，并通過ELISA和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(realtimepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基因表達變化。
　　目的
　　觀察氧化低密度脂蛋白(oxygenizedlowdensitylipoprotein，oxLDL)和Lp-PLA2RNA干擾對RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基

4、因活性及其mRNA表達的影響。
　　方法
　　我們構(gòu)建Lp-PLA2RNA干擾慢病毒或者陰性對照慢病毒(negativecontrol，NC)，滴度1×109TU(transductionunits)/ml;用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細胞。RAW264.7細胞經(jīng)oxLDL預(yù)處理后，Lp-PLA2活性及其mRNA表達明顯增加。在后續(xù)試驗中我們采用60μg/mloxLDL對細胞進行預(yù)處理因為60μ

5、g/ml時oxLDL作用已達平臺期。然后我們對RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染NC慢病毒或者不同的Lp-PLA2RNAi慢病毒載體（病毒感染復(fù)數(shù)=50）來確定沉默效率。我們應(yīng)用ELISA和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.在oxLDL預(yù)處理前RAW264.7細胞Lp-PLA2表達水平極低;oxLDL可明顯上調(diào)RAW264.7細胞Lp-PLA2活性及其mRNA表達，且其作用呈時間和劑量依賴

6、性。在oxLDL濃度遞增至60μg/ml時Lp-PLA2的表達已達平臺期。因此在后續(xù)實驗中我們采用60μg/mloxLDL對RAW264.7細胞進行預(yù)處理。
　　2.基因沉默分析顯示Lp-PLA2-siteA降低RAW264.7細胞Lp-PLA2表達最有效。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的Lp-PLA2RNA干擾可明顯抑制oxLDL引起的RAW264.7細胞MCP-1、IL-6及MMP-8表達增高。
　　結(jié)論
　　慢病毒介

7、導(dǎo)的Lp-PLA2RNA干擾可明顯逆轉(zhuǎn)oxLDL刺激引起的RAW264.7細胞Lp-PLA2及炎癥基因高表達
　　第二部分:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2RNA干擾抑制載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究
　　研究背景
　　盡管目前我們對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的諸多傳統(tǒng)危險因子采取了強化治療方案，但許多病人依舊不能免于冠脈事件的初發(fā)及復(fù)發(fā)。AS是一個復(fù)雜的多因素過程并與炎癥有密切聯(lián)系。AS過

8、程中存在脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)過表達。Lp-PLA2可通過水解氧化磷脂生成具有強大生物學(xué)活性的溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸，它們都在AS進展過程中起關(guān)鍵作用。抑制炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑。已證實RNA干擾在抑制分裂細胞和非分裂細胞目的基因表達方面非常有效。在本研究中，我們構(gòu)建載脂蛋白E基因敲除小鼠(apolipoproteinE-

9、deficientmice，apoE-/-小鼠)AS模型，并采用RNA干擾技術(shù)來降低Lp-PLA2的表達，然后我們檢測了斑塊形態(tài)學(xué)和炎癥基因表達的變化并就此過程進行了深入的機制研究。
　　目的
　　驗證慢病毒介導(dǎo)的Lp-PLA2RNA干擾是否可以抑制apoE-/-小鼠AS形成。
　　方法
　　86只apoE-/-小鼠均喂養(yǎng)高脂飲食，并在它們的左頸總動脈上放置一個縮窄性硅膠套管來誘導(dǎo)AS斑塊形成。我們正中切開小鼠頸

10、部皮膚，小心分離皮下組織，分離頸部肌肉，暴露左頸總動脈，在頸總動脈上放置一個長3mm、內(nèi)徑0.3mm的縮窄性硅膠套管，并用三根絲線固定牢固。apoE-/-小鼠被隨機分為Lp-PLA2RNAi組、病毒陰性對照組(NC組)和對照組。然后我們構(gòu)建Lp-PLA2RNA干擾慢病毒或NC慢病毒載體，8周后對小鼠AS模型進行頸動脈斑塊慢病毒轉(zhuǎn)染，對照組應(yīng)用生理鹽水。七周后收集斑塊采用HE、油紅O和MASSON染色進行病理組織學(xué)檢查;并采用ELISA和

11、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)檢測血漿和斑塊局部Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.慢病毒轉(zhuǎn)染7周后，與對照組及NC組相比，Lp-PLA2RNAi組血漿Lp-PLA2濃度及斑塊局部Lp-PLA2mRNA表達水平均明顯降低;且Lp-PLA2RNAi組小鼠斑塊局部及全身炎癥基因表達水平均明顯降低。
　　2.Lp-PLA2RNA干擾也能明顯減輕斑塊進展，減輕斑塊面積，增加纖維帽厚度，并減少斑塊脂質(zhì)含量，增加斑

12、塊膠原含量，說明斑塊穩(wěn)定性增加。
　　3.Lp-PLA2RNA干擾對AS的有益作用是獨立于降脂作用之外的，因為我們發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2RNAi組、NC組和對照組組間總膽固醇和甘油三酯水平均無顯著性差異。
　　結(jié)論
　　我們的研究結(jié)果說明慢病毒介導(dǎo)的Lp-PLA2RNA干擾可減輕apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化并增加斑塊的穩(wěn)定性，且這種有益作用是獨立于降脂作用之外的。
　　第三部分:脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抑制劑及RNA干

13、擾影響載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的對比研究
　　研究背景
　　盡管目前我們對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的治療取得了長足進展，但是許多表面健康的AS患者依然會發(fā)生猝死，甚至沒有任何前驅(qū)癥狀。這促使我們進一步尋找新的動脈粥樣硬化危險因子和治療靶點。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是一個新型的AS危險因子和標(biāo)志物，AS

14、過程中存在Lp-PLA2過表達。目前Lp-PLA2的特異性抑制劑darapladib吸引了眾多人的關(guān)注。以往多項動物實驗表明darapladib可以減少斑塊內(nèi)LPC含量，抑制促AS炎癥基因表達，并減少斑塊壞死核心的形成。然而，在關(guān)于darapladib的Ⅱ期大型臨床試驗中，Lp-PLA2抑制劑darapladib并未改變?nèi)祟惞跔顒用}斑塊的體積。所以，實驗室和流行病學(xué)證據(jù)關(guān)于darapladib對AS的影響仍存在爭議。已證實RNA干擾在抑

15、制分裂細胞和非分裂細胞目的基因表達方面非常有效。在本研究中，我們采用兩種方法(darapladib和Lp-PLA2RNAi)抑制小鼠Lp-PLA2的表達，并觀察Lp-PLA2表達下降對AS及炎癥基因表達的影響，探討治療動脈粥樣硬化的新機制。
　　目的
　　Lp-PLA2在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程起重要作用，特別是在晚期斑塊中起重要作用。在本研究中，我們比較了darapladib（一種選擇性的Lp-PLA2抑制劑），與慢病毒介導(dǎo)

16、的Lp-PLA2RNA干擾對載脂蛋白E基因敲除小鼠AS模型的炎癥基因表達和動脈粥樣硬化的影響。
　　方法
　　96只apoE-/-小鼠均喂養(yǎng)高脂飲食，并在它們的左頸總動脈上放置一個縮窄性硅膠套管來誘導(dǎo)AS斑塊形成。我們正中切開小鼠頸部皮膚，小心分離皮下組織，分離頸部肌肉，暴露左頸總動脈，在頸總動脈上放置一個長3mm、內(nèi)徑0.3mm的縮窄性硅膠套管，并用三根絲線固定牢固。apoE-/-小鼠被隨機分為對照組、病毒陰性對照組（NC

17、組）、darapladib組和Lp-PLA2RNA干擾(Lp-PLA2RNAi)組。8周后，慢病毒介導(dǎo)的Lp-PLA2RNA干擾或darapladib被用來降低小鼠AS斑塊局部Lp-PLA2的表達。5周后收集斑塊采用HE、油紅O和MASSON染色進行病理組織學(xué)檢查。我們還在蛋白和mRNA水平檢測了AS斑塊局部Lp-PLA2及炎癥基因表達的變化。
　　結(jié)果
　　1.與非處理組小鼠（對照組+NC組）相比，處理組小鼠(darapl

18、adib組+Lp-PLA2RNAi)組）血漿促炎因子的表達顯著減少，而血漿抗炎因子的表達顯著增加。
　　2.此外，我們的研究結(jié)果表明處理組小鼠抑制Lp-PLA2表達后，AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著減少，而膠原含量顯著增加。有趣的是，當(dāng)比較這兩種Lp-PLA2的抑制方法后，我們發(fā)現(xiàn)，與darapladib組相比，Lp-PLA2RNAi組小鼠斑塊面積減少和斑塊穩(wěn)定性的增加更顯著。單純Darapladib治療不能影響動脈粥樣硬化斑塊面積。