慢病毒介導(dǎo)的CDK8基因的穩(wěn)定沉默抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長.pdf

1、研究目的：
　　探討慢病毒介導(dǎo)的CDK8基因的穩(wěn)定沉默在體外和活體水平對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響，并闡明其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.表達(dá)luciferase的結(jié)腸癌細(xì)胞株的構(gòu)建
　　將PRC/CMV2-luc真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)luciferase的SW480-luc細(xì)胞單克隆，挑取單克隆并傳代，中間每5代檢測一次luciferase的活性，并淘汰luciferase活性低

2、的克隆。一直傳代至40代，并比較所建立的穩(wěn)定表達(dá)luciferase的SW480-luc細(xì)胞與母細(xì)胞SW480的生長特性。
　　2.制備表達(dá)針對CDK8基因的shRNA的慢病毒并感染SW480-luc細(xì)胞，并篩選得到穩(wěn)定沉默CDK8基因的單克隆細(xì)胞。
　　制備表達(dá)針對CDK8基因的shRNA的慢病毒，并感染SW480-luc細(xì)胞，然后加嘌呤霉素篩選，挑取單克隆，并建立穩(wěn)定沉默 CDK8基因的克隆 shCDK8及陰性對照的克隆

3、mock；然后分別用熒光定量PCR和western blotting檢測CDK8基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率。
　　3.檢測CDK8基因的穩(wěn)定沉默在體外和活體水平對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　首先用MTT法檢測沉默CDK8基因的克隆的細(xì)胞增殖，再用熒光定量PCR檢測 CDK8所調(diào)控基因如 c-Myc和MMP-7的表達(dá)；將穩(wěn)定沉默 CDK8基因的shCDK8細(xì)胞及陰性對照的mock細(xì)胞分別接種在裸鼠的左

4、右前肢腋下，然后用活體成像系統(tǒng)連續(xù)觀察腫瘤的生長。
　　結(jié)果:
　　1.建立了四株穩(wěn)定高表達(dá)luciferase的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480-luc，并比較了其與母細(xì)胞SW480的生長特性。發(fā)現(xiàn)其生長特性與母細(xì)胞無明顯差別。
　　2.獲得穩(wěn)定沉默 CDK8的細(xì)胞克隆及陰性對照克隆各三個(gè)，分別命名為shCDK8-1、shCDK8-2、shCDK8-3,陰性對照克隆分別命名為mock-1、mock-2、mock-3。shCDK

5、8克隆相對于SW480的沉默效率為沉默效率分別為74.7％，71.3%，68.5%，而蛋白水平也有明顯下調(diào)；而mock克隆的CDK8基因相對于SW480-luc在mRNA的表達(dá)分別為1.04，1.08和0.96。
　　3.用MTT法連續(xù)觀察五天shCDK8克隆和mock克隆生長情況，可見shCDK8的三個(gè)克隆的增殖速度與mock三個(gè)克隆相比明顯減慢；用熒光定量PCR檢測 CDK8基因所調(diào)控的b-catenin、c-Myc和MMP-

6、7基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)b-catenin、c-Myc和MMP-7的表達(dá)也有明顯下調(diào)；將 shCDK8-1細(xì)胞和mock-1細(xì)胞分別接種在裸鼠的左右前肢腋下，可見沉默組的腫瘤生長明顯比陰性對照組慢。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示沉默組腫瘤組織中CDK8基因明顯下調(diào)，熒光定量PCR結(jié)果顯示沉默組腫瘤組織中CDK8、b-catenin，c-Myc and MMP-7基因明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.重組shRNA慢病毒可顯著下調(diào)C