昆明地區(qū)戊型肝炎流行病學(xué)調(diào)查及豬戊型肝炎病毒感染動(dòng)物模型的建立.pdf

1、戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染引起的一種人畜共患病，主要暴發(fā)和流行于亞洲和非洲一些衛(wèi)生條件相對(duì)較差的發(fā)展中國家。人對(duì)HEV普遍易感，易感人群以大齡兒童和青壯年為主。在孕婦中可導(dǎo)致流產(chǎn)或引起死亡，病死率高達(dá)到15％～30％。2002～2004年衛(wèi)生部傳染病疫情報(bào)告顯示我國是戊型肝炎高發(fā)的國家，呈現(xiàn)持續(xù)增長的態(tài)勢，HE已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多的研究證

2、據(jù)表明HEV可感染豬、犬、牛、山羊、綿羊、鹿、靈長類、雞、貝類、嚙齒類等多種動(dòng)物，在這些動(dòng)物宿主中感染率最高是豬，而且從豬中分離到的病毒基因序列和人源毒株有較高的同源性。加之HEV與其它嗜肝性病毒相似，易降解、不穩(wěn)定，很難從糞便、膽汁等中分離到較大量的純HEV，缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在很大程度上限制了HEV深入的研究。為了解昆明地區(qū)戊型肝炎流行情況和探索建立豬HEV感染動(dòng)物模型，我們開展了昆明地區(qū)人、豬、犬HE的血清流行病學(xué)調(diào)查，并以

3、長爪沙鼠和樹鼩建立豬HEV感染模型。本研究為進(jìn)一步研究豬HEV的感染機(jī)制、研制有效的防控手段奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.昆明地區(qū)戊型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)人、豬、犬戊型肝炎的血清流行病學(xué)特征，應(yīng)用雙夾心抗原ELISA對(duì)采集自昆明地區(qū)人血清樣品456份、豬血清樣品835份、犬血清樣品285份進(jìn)行HEV IgG抗體檢測。結(jié)果表明昆明地區(qū)人、豬、犬血清樣品中HEV IgG抗體陽性分別為43.20％、55.4

4、5％、20.35％。人群中男性和女性HEV IgG抗體陽性率分別為43.25％和43.11％，男性和女性二者之間無顯著差異(P＞0.05);21～30歲(48.82％)、31～40歲(50.86％)、41～50歲(42.86％)人群的HEV抗體陽性率顯著高于10～20歲(23.08％)、51歲以上(32.89％)人群(P＜0.05)。豬群中仔豬（1月齡～2月齡）、育肥豬（2月齡～6月齡）、種豬（6月齡以上）HEV IgG抗體陽性率分別為

5、46.85％、57.06％、65.42％。不同年齡組豬群抗HEV IgG陽性率存在差異且差異顯著(P＜0.05)。犬群中城市流浪犬、家庭散養(yǎng)犬和養(yǎng)殖場犬HEV IgG抗體陽性率分別為59.18％、13.16％和10.71％，家庭散養(yǎng)犬、養(yǎng)殖場犬HEV與流浪犬HEV IgG抗體陽性率差異顯著(P＜0.05)。德國牧羊犬、昆明犬與雪橇犬、其他品種之間及雪橇犬與其他品種之間HEV IgG抗體陽性率顯著差異(P＜0.05)。1歲以下與1～5歲、

6、5～10歲、10歲以上犬HEV IgG抗體陽性率顯著差異(P＜0.05)。研究表明昆明地區(qū)人、豬、犬中存在戊型肝炎的流行，人群、豬群和犬HEV IgG陽性率與年齡有關(guān)，21～50歲人群HEV IgG抗體陽性率相對(duì)10～20歲、51歲以上較高;豬群HEV IgG陽性率隨年齡的增長而逐步升高;犬HEV IgG抗體陽性率隨年齡的增長而逐步下降。
　　2.昆明及周邊縣豬戊型肝炎病毒分子流行病學(xué)調(diào)查研究。為了解昆明地區(qū)規(guī)?；i場中仔豬HEV

7、的分子背景和流行特征，針對(duì)GenBank中HEV的ORF2保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)巢式PCR引物。分別對(duì)采集自昆明及周邊縣的187份仔豬糞便樣品進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增出348bp左右的片段為陽性，陽性率為6.95％。祿勸縣、江川縣、富民縣陽性率分別為4.54％、8.00％、9.52％。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，9株豬HEV348bp擴(kuò)增片段的核苷酸同源性為87.1％～99.4％，與HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ型同源性分別為77.

8、0％～81.9％、52.2％～53.6％、77.0％～88.2％，與HEVⅣ型的同源性為77.9％～96.8％。通過遺傳進(jìn)化樹分析得出所檢測到的9株豬HEV毒株均為HEV基因Ⅳ型。研究表明昆明地區(qū)規(guī)?；i場中仔豬群中存在HEV感染并且都為基因Ⅳ型。
　　3.戊型肝炎病毒感染豬肝臟的組織病理學(xué)觀察。為了解豬戊型肝炎病毒感染肝的組織病理學(xué)變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和蘇木素-伊紅染色對(duì)采集自昆明地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場上的待售豬肝樣品176份進(jìn)行了

9、組織病理學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)染色觀察得出，市售豬肝呈HEV抗原陽性率為65.34％。蘇木素-伊紅染色觀察得出，51.30％的豬肝組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，28.70％的豬肝組織出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，20.87％的豬肝出現(xiàn)肝細(xì)胞萎縮，19.13％的豬肝出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死。研究表明昆明地區(qū)市售豬肝中普遍存在HEV感染并出現(xiàn)相應(yīng)的病理學(xué)變化。
　　4.豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠模型的可能性

10、，應(yīng)用HEV陽性豬糞便上清液腹腔注射接種長爪沙鼠，定期檢測長爪沙鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸中HEV RNA的產(chǎn)生，病理組織學(xué)變化及HEV在肝臟中的分布情況。結(jié)果表明長爪沙鼠接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步上升，此后開始降低。但ALT值到接種后35天還是沒有降低到對(duì)照組水平，攻毒組比陰性對(duì)照組數(shù)值高出2倍左右。AST到接種后35天基本回落到正常范圍內(nèi)（根據(jù)陰性對(duì)

11、照）。糞便和肝臟中均能檢測到HEV RNA，血液和小腸偶能檢測HEV RNA。肝臟組織觀察到肝小葉間淋巴細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞顆粒變性，局灶性淋巴細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞索排列紊亂、膽管增生等。后期表現(xiàn)為多發(fā)性淋巴細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死，枯否細(xì)胞增多，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生。小腸、腎、腦、脾臟等組織也有不同程度病理變化。免疫組化檢測結(jié)果可見到肝細(xì)胞漿中有強(qiáng)陽性信號(hào)。說明成功建立了豬戊型肝炎病毒感染長爪沙鼠模型。
　　5.豬戊型肝炎病毒感染樹鼩的實(shí)

12、驗(yàn)研究。為了探討建立豬戊型肝炎病毒感染樹鼩模型的可能性，應(yīng)用HEV RNA陽性豬糞便上清液腹腔注射接種樹鼩，定期檢測樹鼩血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平的變化及肝臟、糞便、血液、小腸、腎臟、脾臟中HEV RNA的產(chǎn)生，病理組織學(xué)變化。結(jié)果表明樹鼩接種豬HEV后7天血清中ALT和AST均同步升高，此后開始降低。但ALT和AST到接種第28天還是沒有降低到對(duì)照組水平，攻毒組比陰性對(duì)照組數(shù)值高。樹鼩接種豬HEV7天