組蛋白乙?；竵喰驮谛∈笮呐K發(fā)育中的時空表達(dá).pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)簡稱先心病，是小兒時期最常見的心血管畸形，是人類最常見的出生缺陷。隨著影像學(xué)和外科與介入手段的不斷發(fā)展，對先心病的診斷和治療有了很大進(jìn)步，但對其發(fā)病機(jī)制了解甚少，多集中在心臟發(fā)育相關(guān)基因研究方面。心臟發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，它涉及胚胎發(fā)育過程中眾多基因在不同時間和空間上的順序精確表達(dá)，并受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[1]。該過程的實現(xiàn)并不是只由基因序列所決定，很大程度上由染

2、色質(zhì)構(gòu)象改變所決定[2]。這種染色質(zhì)構(gòu)象改變又叫作染色質(zhì)重塑 (chromatinremodeling)，屬于表觀遺傳學(xué)(epigenetic)研究范疇[3]，而目前關(guān)于心臟發(fā)育表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究甚少，那么在調(diào)控基因表達(dá)層面上，從表觀遺傳學(xué)的全新角度認(rèn)識心臟發(fā)育機(jī)制具有重大科學(xué)意義。 表觀遺傳學(xué)包括DNA修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控[4]三個層面。近年來研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；揎椩谂咛グl(fā)育中起重要調(diào)控作用。組蛋白乙酰化酶(h

3、istone acetyltransferases，HATs)是催化組蛋白引起乙酰化修飾的酶，決定心肌組織中組蛋白乙?；揎椝?，從而影響心臟發(fā)育基因的時序表達(dá)調(diào)控。因此，要闡明心臟發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控模式，需從研究發(fā)育心臟中HATs的時空表達(dá)變化入手。 目的： 本研究通過檢測與心臟有關(guān)的5種HATs亞型-p300、CBP、GCN5、PCAF和SRC1在發(fā)育心臟中的時空表達(dá)變化，建立胚胎心臟發(fā)育過程中不同HATs亞型時間劑

4、量曲線，初步探討各HATs亞型與心臟發(fā)生發(fā)育的關(guān)系。 材料與方法選取胎齡7.5～18天、出生1天和3月成年昆明小鼠正常心臟，通過大體觀察和石蠟切片HE染色技術(shù)詳細(xì)描述心臟發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化；利用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR技術(shù)動態(tài)檢測p300、CBP和GCN5在心臟發(fā)育過程中的蛋白表達(dá)分布和mRNA時序性表達(dá)變化；采用免疫組織化學(xué)法和Western blot技術(shù)動態(tài)分析PCAF和SRC1在小鼠心臟發(fā)育過程中的蛋白表達(dá)時空變化規(guī)律，

5、建立心臟發(fā)育過程中不同HATs亞型的時間劑量曲線。 結(jié)果： 1.小鼠胚胎(embryo E)7.5天出現(xiàn)新月形心臟原基，E8.5～E9.5出現(xiàn)原始心管并環(huán)化， E10.5房室管形成并出現(xiàn)心內(nèi)膜墊和突入心室腔的小梁，E11.5～E13.5房間隔形成，E11.5～E14.5室間隔形成，E12.5～E15.5房室瓣形成，E11.5～E13.5流出道被分割為主動脈和肺動脈，E11.5～E16.5心肌細(xì)胞分化增殖使心壁致密變厚，E

6、16.5～生后1天心肌細(xì)胞增殖增大使心壁更厚且心臟體積增大明顯，生后心臟隨小鼠生長而增大，心肌細(xì)胞不再增殖。心肌細(xì)胞在胚胎時期為多邊形，生后一周內(nèi)逐漸過渡到成年時期的短柱狀。 2.p300和CBP在心臟發(fā)育過程中的時空表達(dá)變化：(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：p300在心臟發(fā)育整個時期心臟各部分均有很強(qiáng)或較強(qiáng)表達(dá)。而CBP在E7.5不表達(dá)；E8.5～E9.5的心管中較強(qiáng)表達(dá)；E10.5～E16.5及E18和生后1天仔鼠期心肌組織較強(qiáng)

7、表達(dá)，房室瓣和小梁網(wǎng)弱表達(dá)，室間隔肌部較弱表達(dá)而膜部表達(dá)更弱；3月成年鼠心肌和小梁較弱表達(dá)，室間隔極弱表達(dá)。與同期同心臟區(qū)域的p300相比，CBP有相對低的陽性細(xì)胞表達(dá)率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(2)RT-PCR 結(jié)果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，p300 mRNA在E10.5～E11.5出現(xiàn)高峰表達(dá)，CBP mRNA在E10.5～E12.5出現(xiàn)高峰表達(dá)，在隨后的心臟發(fā)育時間點(diǎn)，二者表達(dá)呈逐漸下降趨勢。 3.

8、GCN5在心臟發(fā)育過程中的時空表達(dá)變化：(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：GCN5在E7.5～E9.5心臟原基中不表達(dá)；E10.5～E11.5發(fā)育心臟中廣泛弱表達(dá)，心內(nèi)膜墊相對強(qiáng)表達(dá)；E12.5后發(fā)育時期心內(nèi)膜墊及其發(fā)育形成的室間隔膜部和房室瓣相對強(qiáng)表達(dá)，心肌組織弱表達(dá)。(2)RT-PCR結(jié)果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，GCN5 mRNA在E10.5～E11.5出現(xiàn)高峰表達(dá)， E12.5～E15.5表達(dá)水平下降，E16.5至成年鼠期表

9、達(dá)極低。 4.PCAF在心臟發(fā)育過程中的時空表達(dá)變化：(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：PCAF 在E7.5～E9.5的心臟原基中廣泛弱表達(dá)；E10.5～生后1天新生鼠期心肌膜較強(qiáng)表達(dá)，心內(nèi)膜、房室瓣和小梁網(wǎng)較弱表達(dá)，室間隔肌部弱表達(dá)，室間隔膜部極弱表達(dá)；3月成年鼠心肌和小梁弱表達(dá)，間隔極弱表達(dá)。(2)Western blot結(jié)果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，PCAF蛋白在E10.5已有相對高表達(dá)，E11.5達(dá)到表達(dá)高峰，此后表

10、達(dá)逐漸降低，在E13.5～E15.5和E16.5～生后1天仔鼠期出現(xiàn)兩個表達(dá)平臺期，在成年鼠期心臟中表達(dá)最低。 5.SRC1在心臟發(fā)育過程中的時空表達(dá)變化：(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：SRC1在E7.5心臟原基中不表達(dá)；E8.5～E9.5的心管中微弱表達(dá)；E10.5后心臟發(fā)育各個階段，小梁弱表達(dá)，心臟其它所有區(qū)域均較強(qiáng)而廣泛表達(dá)。(2)Western blot結(jié)果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，SRC1蛋白在E10.5表達(dá)較低，E1