葫蘆素E引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的初步研究.pdf

1、目的：以可分裂的GFP蛋白作為基礎(chǔ)，本研究了建立熒光蛋白系統(tǒng)，模擬細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的途徑。利用此系統(tǒng)篩選了可能對ER產(chǎn)生作用的藥物，并對這些藥物做出基本檢測，確定其確實的抗腫瘤作用。同時通過另外一種檢測方式，來證實此系統(tǒng)篩選藥物的可行性。從而為以后藥物性質(zhì)的檢測提供可行的簡單途徑。
　　方法：利用限制性酶切，我們將可分裂的 GFP蛋白S-1端連接在表達(dá)錯誤折疊蛋白的質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，同時將 S-10端轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，使其在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)

2、定表達(dá)。先用蛋白酶抑制劑（MG132）阻斷持續(xù)表達(dá)錯誤蛋白的熒光細(xì)胞的蛋白降解途徑，細(xì)胞的熒光值會持續(xù)增加。繼而再加入篩選藥物，通過6小時的處理后，測定熒光值，通過熒光值的改變可確定通過對ER作用的抗腫瘤藥物。WB確定藥物確實對 ER-stress的影響。從篩選的藥物中任一選取一種，流式細(xì)胞術(shù)確定其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。將表達(dá)錯誤折疊蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，同時加入蛋白合成抑制劑及篩選藥物，WB測定錯誤折疊蛋白的表達(dá)，以確定藥物可使錯誤折疊蛋

3、白被阻斷至ER中，通過加大ER負(fù)荷而導(dǎo)致ER-stress。
　　結(jié)果：運用本研究前期建立的熒光細(xì)胞系統(tǒng)，篩選出了11種化合物或自然衍生物藥物，其對于熒光值的影響都≥50％，并且熒光值的改變與藥物的濃度成正相關(guān)。通過WB可確定此11種藥物均可對ER-stress相關(guān)蛋白產(chǎn)生影響。對于隨機(jī)選取的藥物 CuE，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明 CuE確實可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且與濃度也呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染表達(dá)錯誤蛋白的質(zhì)粒后 WB的結(jié)果證實被篩選藥物阻斷錯誤