Wnt3a基因轉(zhuǎn)染對神經(jīng)干細胞增殖、分化影響的體外研究.pdf

1、研究目的：
　　 探討Wnt3a基因轉(zhuǎn)染在神經(jīng)干細胞（NSCs）體外增殖、分化機制中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.NSCs培養(yǎng)與鑒定 取孕14天的胎鼠海馬組織，分離NSCs，進行傳代培養(yǎng)，Nestin鑒定及形態(tài)觀察。NSCs無血清分化培養(yǎng)基+貼壁培養(yǎng)的方法誘導分化，免疫熒光細胞化學法(ICC)檢測神經(jīng)元標志物β-tubulin和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達情況；使用流式細胞術(shù)（FACS）檢測NSCs

2、純度。
　　 2.病毒構(gòu)建 采用同源重組技術(shù)將小鼠Wnt3a基因插入慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中，構(gòu)建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重組質(zhì)粒。XhoI 和 BamHI 雙酶切測序分析鑒定插入片段的正確性。通過pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1重組慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝病毒，并測定病毒滴度。
　　 3.慢病毒轉(zhuǎn)染 使用構(gòu)建的pLVX-Wnt3a

3、-IRES-ZsGreen1慢病毒載體轉(zhuǎn)染NSCs；采用ICC法對轉(zhuǎn)染后的NSCs 進行Nestin鑒定以及分化方向鑒定；采用real-time PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后NSCs的Wnt3a mRNA表達量和穩(wěn)定性，使用Western Blot檢測Wnt3a、β-catenin蛋白的表達水平。
　　 4.Wnt3a基因轉(zhuǎn)染對NSCs增殖、分化的影響 在轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5、6、7、10、14d使用WST-1法檢測NSCs增殖

4、能力；在轉(zhuǎn)染后14天，使用FACS檢測轉(zhuǎn)染后NSCs中 BrdU+ 細胞比例；FACS檢測轉(zhuǎn)染的NSCs向β-tubulin+ 細胞分化比例。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.成功從胎鼠海馬組織分離、培養(yǎng)NSCs，誘導分化后可分化為β-tubulin+和GFAP+細胞；連續(xù)傳代3次后絕大部分細胞Nestin表達陽性，NSCs純度91.71％。
　　 2.成功構(gòu)建Wnt3a-GFP共表達慢病毒載體（pLVX-Wnt

5、3a-IRES-ZsGreen1） 經(jīng)限制性內(nèi)切酶檢測、基因測序及和綠色熒光觀察證實成功的構(gòu)建了攜帶Wnt3a基因的重組慢病毒，滴度高達3×108 TU/ml。
　　 3.Wnt3a-GFP共表達慢病毒成功感染NSCs pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1轉(zhuǎn)染后NSCs在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，Nestin表達陽性；誘導分化后可見β-tubulin+和GFAP+細胞；real-time PCR和Western Bl

6、ot檢測Wnt3a、β-catenin表達水平均明顯高于對照組（p<0.01）。
　　 4.Wnt3a基因轉(zhuǎn)染促進NSCs的增殖與神經(jīng)元方向分化 WST-1檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后7、10、14d Wnt3a基因轉(zhuǎn)染NSCs組的吸光度值明顯高于對照組（p<0.05）。轉(zhuǎn)染后2周FACS結(jié)果顯示52.61％±2.21％的細胞呈BrdU陽性；誘導分化后，30.23％±3.62％的細胞呈β-tubulin陽性，與對照組相比有統(tǒng)計學顯著性差