HIF-1α基因干擾抑制大鼠肝癌CBRH7919細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。全世界45％的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國(guó)，位列我國(guó)癌癥患者死亡原因第二位。其惡性程度很高，極易發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低，手術(shù)療效較差。即使是小肝癌(＜5cm)行根治術(shù)或肝臟移植術(shù)后，3年內(nèi)復(fù)發(fā)率也高達(dá)50％以上。肝癌的治療方法很多，包括早期切除、二期切除、經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)(TACE)、局部消融(微波、射頻等)及適形放療、生物治療、中藥等綜合治療。目前經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療肝癌已成為肝癌非手術(shù)治療的

2、首選方法，但其遠(yuǎn)期療效仍欠理想，術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移發(fā)生率較大。如何提高TACE遠(yuǎn)期療效，防止腫瘤進(jìn)展，延長(zhǎng)患者生存期是當(dāng)前的主要研究目標(biāo)。
　　 目前研究證實(shí)導(dǎo)致TACE遠(yuǎn)期效果不理想的原因有：腫瘤壞死不徹底，血管新生，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。研究表明在腫瘤對(duì)缺氧缺血反應(yīng)中，HIF-1及VEGF發(fā)揮著重要的作用。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉(zhuǎn)錄因子，其可激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)靶蛋白的生成并

3、發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，引起細(xì)胞對(duì)缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)如使細(xì)胞無(wú)氧酵解加強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤血管的新生并引起腫瘤自身的侵襲性增加和對(duì)放化療的抗拒性增加。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因有60余種，主要有血紅素加氧酶和糖酵解酶等、VEGF、EPO、P53和血小板衍生生長(zhǎng)因子β(PDGF-β)等。HIF-1由α亞基和β亞基組成，HIF-1的生理活性是由HIF-1α亞基的活性和表達(dá)決定的。
　　 由此可見(jiàn)，HIF-1α在肝癌TACE術(shù)后殘留、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

4、中發(fā)揮重要的作用，在分子水平沉默HIF-1α表達(dá)對(duì)提高TACE治療肝癌的療效具有極大的應(yīng)用前景。
　　 RNAi(RNA interference)是現(xiàn)階段最新的基因技術(shù)，它是指通過(guò)人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。
　　 目前的研究可以推斷TACE聯(lián)合RNAi技術(shù)抑制HIF-1α基因表達(dá)將為肝癌的

5、綜合治療帶來(lái)嶄新的研究方向。
　　 大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株來(lái)源于用二乙基亞硝胺(DENA)誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌，可分泌AFP，病理學(xué)上為肝細(xì)胞性肝癌，具有與肝細(xì)胞性肝癌相同的生物學(xué)特性。制作成功的大鼠肝癌模型，經(jīng)體表超聲檢查可發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)有腫塊存在，并且可進(jìn)行介入操作，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作提供一個(gè)好的平臺(tái)。
　　 本課題研究利用CoCl2誘導(dǎo)大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬TACE術(shù)后缺氧環(huán)境，并在模擬缺氧環(huán)境下利

6、用HIF-1αsiRNA敲除HIF-1α基因從而抑制大鼠肝癌細(xì)胞模擬缺氧條件下HIF-1α及VEGF的表達(dá)，為下一步活體實(shí)驗(yàn)提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為肝癌的綜合治療提供一種新的手段。
　　 第一部分
　　 目的：觀察在不同濃度的CoCl2作用下大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α及VEGF在轉(zhuǎn)錄水平上各組表達(dá)的變化，建立理想的大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株體外模擬缺氧模型，探討模擬缺氧條件下HIF-1α與VEGF基因

7、表達(dá)的相關(guān)性。
　　 方法：本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
　　 1、檢測(cè)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型中CoCl2合適藥物濃度。
　　 2、 MTT實(shí)驗(yàn)?zāi)M缺氧條件下不同濃度CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的影響。
　　 3、 realtime RT-PCR檢測(cè)HIF-1α，VEGF的mRNA在模擬缺氧條件下不同時(shí)段大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株中的表達(dá)水平。
　　

8、 結(jié)果：
　　 1、模擬缺氧12h條件下濃度為100μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)無(wú)影響；濃度為150μmol/L，200μmol/L及300μmol/L,的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)有輕度抑制作用。模擬缺氧24h條件下濃度為100μmol/L及150μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用;濃度為200μm

9、ol/L及300μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)有明顯抑制作用。
　　 2、 realtime RT-PCR檢測(cè)模擬缺氧條件下HIF-1α，VEGF的mRNA的表達(dá)情況。模擬缺氧24h，在不同濃度CoCl2作用下，HIF-1α，VEGF表達(dá)上調(diào)，以CoCl2濃度為200μmol/L上調(diào)最高，其次是濃度為150μmol/L組。
　　 3、分析正常組與模擬缺氧組之間HIF-1α，VE

10、GFmRNA表達(dá)的相關(guān)性，r=0.982，P＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用濃度為150μmol/L的CoCl2孵育24h制作的大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)影響無(wú)明顯抑制作用，且HIF-1α，VEGF上調(diào)明顯，能成功建立理想的體外大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型。
　　 2、模擬缺氧條件下大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α，VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，

11、且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 第二部分
　　 目的：研究HIF-1αsiRNA對(duì)模擬缺氧狀態(tài)下大鼠肝癌細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響，為HIF-1α基因干擾應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　 方法：本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
　　 1、根據(jù)HIF-1α基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)HIF-1αsiRNA、一對(duì)陰性對(duì)照siRNA及一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照siRNA。
　　 2、利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體把FAM-siR

12、NA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，確保轉(zhuǎn)染效率大于90％。
　　 3、利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體把HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，模擬缺氧孵育24h后，realtime RT-PCR檢測(cè)HIF-1α，VEGF的mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、在細(xì)胞匯合度為30％-50％情況下轉(zhuǎn)染，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90％-95％。
　　 2、 realtime RT-PCR檢測(cè)模擬缺氧條件下，轉(zhuǎn)染siRNA入大鼠肝癌CBRH-7

13、919細(xì)胞株后HIF-1α，VEGFmRNA表達(dá)情況，HIF-1αmRNA表達(dá)下降75％-80％，VEGFmRNA表達(dá)下降70％-75％。
　　 結(jié)論：
　　 1、模擬缺氧條件下轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA后，大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α，VEGFmRNA表達(dá)明顯受抑制。HIF-1αsiRNA序列1是干擾效果明顯的小干擾RNA。
　　 2、篩選出一對(duì)能高效抑制HIF-1α表達(dá)的siRNA序列，為下一