海參腦苷脂的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及其生物活性研究.pdf

1、海參是一種名貴的海洋滋補(bǔ)品,富含多種生物活性成分,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。海參腦苷脂及長(zhǎng)鏈堿是存在于海參體壁中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的鞘脂類化合物,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗菌等生理活性。海參腦苷脂包括三種主要系列物,每種系列物中含有幾十種單體化合物。本論文對(duì)仿刺參、海地瓜和葉瓜參三種海參的腦苷脂及長(zhǎng)鏈堿的分離純化、分子組成和結(jié)構(gòu)以及生理活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,對(duì)于海洋新原料來(lái)源的發(fā)現(xiàn)、海參新型營(yíng)養(yǎng)功效的補(bǔ)充、海參的高值化開(kāi)發(fā)利用具有

2、重要意義。本文研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.建立海參中腦苷脂含量簡(jiǎn)便準(zhǔn)確測(cè)定的新方法。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD),以TSK gel CN-80Ts柱為分離柱,正己烷-異丙醇-二氯甲烷-甲醇為流動(dòng)相,在13min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了腦苷脂和神經(jīng)酰胺的同時(shí)測(cè)定。其中,腦苷脂的檢出限為0.01μg,加標(biāo)平均回收率為94.28％,RSD為5.67％,方法穩(wěn)定性良好。在所測(cè)13種水產(chǎn)樣品中,海星的腦苷脂和神經(jīng)酰胺含量最

3、高,在所測(cè)8種海參中葉瓜參腦苷脂含量最高。結(jié)果表明該方法可行,樣品前處理簡(jiǎn)單,快速準(zhǔn)確。結(jié)果提示包括海參在內(nèi)的海洋食品可以作為功能性鞘脂類的良好資源。
　　 2.建立一套用于各種海參腦苷脂分離純化的快速高效的完整新體系。首次應(yīng)用高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)成功優(yōu)化了海參腦苷脂的分離過(guò)程。(1)海參總腦苷脂:采用石油醚-甲醇-水(5:4:1,V/V)為溶劑體系的高速逆流色譜法,從海參總脂中一步純化制備出海參總腦苷脂,以總脂計(jì)得率

4、約為7.6～12.4％,經(jīng)正相HPLC-ELSD法檢測(cè)其純度達(dá)90％以上。(2)海參腦苷脂系列物:先經(jīng)一次正相硅膠柱層析,收集氯仿:甲醇(80:20,V/V)洗脫組分,再采用乙酸乙酯-乙醇-水(5:3.5:3.5,V/V)為溶劑體系的高速逆流色譜技術(shù),將上述洗脫組分中嚴(yán)重干擾海參腦苷脂純化的硫酸酯化甾醇去除,制得海參腦苷脂系列物的總得率約為1.1～6.4％,純度均在90％以上。并以優(yōu)化出的正相HPLC制備法進(jìn)行了驗(yàn)證比較。(3)海參腦苷

5、脂單體化合物:采用反相HPLC法,C18半制備柱,98％甲醇水溶液洗脫,從海地瓜腦苷脂系列物中分離出4個(gè)腦苷脂單體化合物,純度在90％以上。結(jié)果表明,所建立的腦苷脂純化體系具有得率高、速度快、成本低等突出優(yōu)點(diǎn),從根本上解決了海參腦苷脂純化的難題。
　　 3.建立海參腦苷脂分子種組成和結(jié)構(gòu)篩選的高通量分析方法。
　　 先采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法,分析比較了三種海參腦苷脂系列物的脂肪酸、長(zhǎng)鏈堿和糖基組成差異。用1

6、0％鹽酸/甲醇水解,正己烷萃取脂肪酸甲脂組分,甲醇保留長(zhǎng)鏈堿和糖基組分。脂肪酸甲酯直接用INNOWax柱分析,長(zhǎng)鏈堿和甲基糖經(jīng)硅烷化衍生后用HP-5MS柱分析。測(cè)定結(jié)果:所有腦苷脂系列物的糖基都為葡萄糖基;腦苷脂系列物Ⅰ的脂肪酸以非羥基脂肪酸為主,系列物Ⅱ和Ⅲ的脂肪酸以羥基脂肪酸為主;系列物Ⅰ和Ⅱ中,少見(jiàn)的d17:1長(zhǎng)鏈堿比例較高,系列物Ⅲ中以t17:0長(zhǎng)鏈堿為主,三種海參相比,仿刺參與葉瓜參的長(zhǎng)鏈堿組成相似,主要為d18:2和d17:

7、1,而海地瓜長(zhǎng)鏈堿組成較簡(jiǎn)單,主要為d17:1和t17:0。并推測(cè)出9種海參腦苷脂系列物的結(jié)構(gòu)通式。
　　 又采用高效液相色譜.電噴霧離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-IT-TOF)技術(shù),篩選分析三種海參總腦苷脂的腦苷脂分子種組成。采用TSKgel ODS-100Z柱分離,95％甲醇/水溶液洗脫,正ESI電離模式,根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜中同時(shí)出現(xiàn)的[M+H]+、[M+Na]+和[M+H-18]+峰確定母離子,通過(guò)自動(dòng)MS/MS采集m

8、/z200～300子離子數(shù)據(jù),并分析它們的結(jié)構(gòu)。分別從海地瓜、葉瓜參和仿刺參總腦苷脂中高通量篩選出12、41、26個(gè)腦苷脂化合物,其中包含疑似新化合物28個(gè)。
　　 最后,應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-Q-TOF)技術(shù),成功建立了高通量、準(zhǔn)確篩選分析腦苷脂分子種組成及結(jié)構(gòu)的新方法。采用Plus C18柱,95％7,腈/水洗脫,負(fù)ESI電離模式,自動(dòng)MS/MS采集數(shù)據(jù),一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z500

9、～1000,利用軟件自動(dòng)提取含m/z179子離子的所有化合物,再根據(jù)二級(jí)子離子掃描篩出其中中性丟失為162的化合物。利用此方法,從海地瓜的三種腦苷脂系列物中分別篩選出28、20、12個(gè)腦苷脂化合物,其中31個(gè)為疑似新化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與GC-MS和LC-ESI-IT-TOF法相比,此法測(cè)定靈敏度更高,結(jié)構(gòu)信息全面,推測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。該方法的建立,為腦苷脂單體化合物的研究提供了捷徑,為構(gòu)效關(guān)系的深入研究提供了結(jié)構(gòu)信息。
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10、.建立海參長(zhǎng)鏈堿的高效制備新方法。海參總脂經(jīng)皂化酸解后,采用溶劑體系為正己烷-甲醇-水(1:2:1,V/V)的高速逆流色譜法分離,以正ESI-MS法確證了長(zhǎng)鏈堿目標(biāo)洗脫組分,分離制備出三種海參長(zhǎng)鏈堿,得率約為6.3％～10.9％,純度均達(dá)到92％以上。采用LC-MS法分析了海參長(zhǎng)鏈堿的組成和結(jié)構(gòu)。該法具有制備量大、純化周期短、得率高等突出優(yōu)點(diǎn)。說(shuō)明高速逆流色譜技術(shù)在長(zhǎng)鏈堿類的快速純化制備研究中具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。
　　 5.研究

11、海參腦苷脂及長(zhǎng)鏈堿的抗腫瘤和抗炎活性,初步探討其構(gòu)效關(guān)系。(1)抗腫瘤作用:主要采用MTT法,分別考察了不同濃度、不同作用時(shí)間下海參腦苷脂及長(zhǎng)鏈堿對(duì)Caco-2,S180和HL-7702三種細(xì)胞系的增殖抑制作用情況。結(jié)果表明,海參總腦苷脂對(duì)Caco-2癌細(xì)胞增殖均有極顯著的抑制作用;不同腦苷脂系列物對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制率存在顯著差異,且活性效果優(yōu)于GalCer,海參長(zhǎng)鏈堿的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性遠(yuǎn)強(qiáng)于腦苷脂本身;提示腦苷脂抗腫瘤活性與化

12、學(xué)結(jié)構(gòu)之間存在構(gòu)效關(guān)系。(2)抗炎作用:采用Caco-2分化成的小腸上皮細(xì)胞,通過(guò)添加TNF-α和不同濃度的葉瓜參腦苷脂,熒光定量PCR法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞炎癥因子IL-8 mRNA的表達(dá)量,表明葉瓜參腦苷脂具有較強(qiáng)的抗炎作用。以上結(jié)果提示,海參腦苷脂尤其是長(zhǎng)鏈堿是重要生物活性成分,在新型海洋功能食品或海洋藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。
　　 通過(guò)以上研究,本文應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù),解決了海參腦苷脂及長(zhǎng)鏈堿分離純化中存在的難