肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達(dá)基因及可變剪接研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種最常見的成人發(fā)病的神經(jīng)退變性疾病,其特征是脊髓、腦干及運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性及相對(duì)選擇性的退變。病人表現(xiàn)為進(jìn)行性的癱瘓與肌肉萎縮,約半數(shù)在發(fā)病3～5年內(nèi)死亡,死因多為呼吸衰竭。每年全球發(fā)病率約為(1～2)/100000,其終生發(fā)病率約為1/600至1/2000。
　　 90％的ALS病例為散發(fā)性,其余10％為家族性,二者的臨床表現(xiàn)及

2、病理特點(diǎn)難以區(qū)分。20％的家族性病例與細(xì)胞質(zhì)中銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)發(fā)生的某種基因突變相關(guān)聯(lián)。這種SOD1基因突變屬于發(fā)揮主導(dǎo)作用的錯(cuò)義突變,致使一種氨基酸被另一種氨基酸所替代,例如甘氨酸被丙氨酸所替代(SOD1-G93A)。因?yàn)楸磉_(dá)人SOD1突變的動(dòng)物亦在成年期發(fā)病,且臨床表現(xiàn)及病理特點(diǎn)與人類患者非常相似,故這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為廣泛采用的ALS動(dòng)物模型。實(shí)際上,絕大多數(shù)的突變SOD1并未影響酶學(xué)活性,其引發(fā)的病理效應(yīng)可能源于

3、生物學(xué)功能方面的毒性獲得。盡管在對(duì)ALS深入研究的基礎(chǔ)上,學(xué)者們提出了解釋SOD1突變效應(yīng)的幾種假說,包括氧化應(yīng)激、谷氨酸毒性、大分子聚集體形成、線粒體功能失調(diào)及凋亡等假說,但是,目前人們對(duì)SOD1突變促發(fā)ALS的確切機(jī)制依然所知甚少。
　　 高效的基因組學(xué)技術(shù)為闡釋復(fù)雜的疾病發(fā)病機(jī)制及其調(diào)控提供了寶貴的機(jī)遇。mRNA轉(zhuǎn)錄本的可變剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要形式,它將mRNA前體中的內(nèi)含子選擇性移除,同時(shí)將外顯子組合連接成多種形式的成

4、熟RNA。數(shù)量有限的基因可擴(kuò)展表達(dá)為非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)組,因此可變剪接在產(chǎn)生蛋白質(zhì)組學(xué)的多態(tài)性方面發(fā)揮著重要的作用。據(jù)估算,在所有的人類基因中發(fā)生可變剪接者約占3/4。目前資料顯示,90％以上的人類基因發(fā)生了可變剪接。ASTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk)資料顯示57％的小鼠基因發(fā)生可變剪接。研究者越來越認(rèn)識(shí)到mRNA剪接在許多重要的生理過程如發(fā)育、生理和疾病中,發(fā)揮著主導(dǎo)作用。Affymetrix外顯子芯片迅速獲得業(yè)

5、界認(rèn)可并成為同時(shí)檢測(cè)基因水平和外顯子水平表達(dá)的操作標(biāo)準(zhǔn)。
　　 新近的研究表明可變剪接在神經(jīng)系統(tǒng)尤其普遍。已有報(bào)道ALS中TARDNA-結(jié)合蛋白43(TDP-43)的異常剪接可增加聚集和細(xì)胞毒性作用。嚙齒類動(dòng)物中的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(在人類稱為EAAT2)以一種復(fù)雜的模式發(fā)生可變剪接,包括5'端與3'非翻譯區(qū)及幾個(gè)編碼區(qū)異構(gòu)體。盡管可變剪接在神經(jīng)系統(tǒng)普遍存在,但在ALS中的研究甚少。
　　 本研究應(yīng)用Affymetrix小鼠

6、外顯子1.0 ST芯片來檢測(cè)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩同性別非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談?dòng)物腰髓基因的差異表達(dá)與外顯子的可變剪接,并通過RT-PCR方法對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。每張芯片大約包含5.4兆個(gè)探針(1.4兆個(gè)探針組),覆蓋了約1百萬(wàn)個(gè)已知的和預(yù)測(cè)的外顯子。大約90％的外顯子被4個(gè)探針?biāo)采w,這些針對(duì)同一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)的探針組成的集合稱為探針組(probesets)。對(duì)每一個(gè)基因而言,平均的探針數(shù)是30～40個(gè),通常分布于整個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列

7、的全長(zhǎng)。上述外顯子芯片可整合每一個(gè)已知的和預(yù)測(cè)的外顯子的表達(dá),為研究可變剪接(外顯子表達(dá)分析)提供了強(qiáng)有力的工具,同時(shí)可對(duì)基因水平的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 本研究首次對(duì)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腰髓進(jìn)行了外顯子芯片分析,以確定在突變SOD1存在的情況下差異表達(dá)基因及可變剪接事件。本課題分為三部分。
　　 第一部分肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達(dá)基因研究
　　 目的:研究在突變SOD1存在的情況下,G93A

8、轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的基因表達(dá)譜。
　　 方法:應(yīng)用Affymetrix小鼠外顯子1.0 ST芯片檢測(cè)發(fā)病期的雌性SOD1-G93A小鼠及非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對(duì)照小鼠腰髓組織的基因轉(zhuǎn)錄本,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類分析、GO分類及生物學(xué)通路分析。
　　 結(jié)果:(1)在突變SOD1蛋白存在的情況下,有322個(gè)轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中309個(gè)(占95.96％)上調(diào),13個(gè)(占4.04％)下調(diào)?；赥檢驗(yàn)的結(jié)果,經(jīng)

9、可視化處理生成一個(gè)火山圖以對(duì)比發(fā)病組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因。(2)通過分層聚類分析,我們可見各樣品之間有很好的可重復(fù)性,而且發(fā)病組與對(duì)照組之間的基因可成功區(qū)分。(3)GO分類。對(duì)這些發(fā)生差異表達(dá)的基因根據(jù)其分子功能進(jìn)行了分類,其中滿足P值＜0.001的上述基因類別包括肝素結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子1結(jié)合、超氧化物引發(fā)的NADPH氧化活性、整合素結(jié)合、脂蛋白酯酶活性及化學(xué)因子活性等。從差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程考慮,主要涉及細(xì)胞黏附、炎癥反

10、應(yīng)及免疫反應(yīng)。同時(shí)還涉及白細(xì)胞黏附、整合素復(fù)合體、整合素介導(dǎo)的信號(hào)途徑以及MAPK活性等。(4)生物學(xué)通路分析。基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析,差異表達(dá)基因主要涉及如下生物學(xué)通路:細(xì)胞因子及其受體相互作用、actin細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞黏附、補(bǔ)體及凝血瀑布、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、細(xì)胞黏附分子及凋亡等。
　　 結(jié)論:肌萎縮側(cè)索硬化模型SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的基因表達(dá)與非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對(duì)照小鼠相比,

11、具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且發(fā)生差異表達(dá)的基因可明確區(qū)分并進(jìn)行相應(yīng)的歸類與分析。
　　 第二部分肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓可變剪接研究
　　 目的:研究在突變SOD1存在的情況下,G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的可變剪接。
　　 方法:應(yīng)用小鼠外顯子1.0 ST芯片檢測(cè)發(fā)病期的雌性SOD1-G93A小鼠及非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對(duì)照小鼠的腰髓組織的可變剪接事件,并對(duì)可變剪接基因進(jìn)行分層聚類分析、GO分類及生物學(xué)通路分析。

12、
　　 結(jié)果:(1)在全部44087個(gè)探針組中,有333個(gè)探針組符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),可用于后繼的分析處理。這些探針組分屬于297個(gè)發(fā)生可變剪接的基因,提示單個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)生多個(gè)可變剪接事件。我們的研究結(jié)果顯示,有63個(gè)發(fā)生可變剪接的外顯子源于27個(gè)轉(zhuǎn)錄本。在多個(gè)編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本中檢測(cè)到3個(gè)或3個(gè)以上出現(xiàn)可變剪接的外顯子,提示了小鼠體內(nèi)剪接調(diào)控模式的復(fù)雜性。(2)根據(jù)其相似性用聚類分析3.0軟件進(jìn)行了HC分析。結(jié)果顯示兩組間具有良好

13、的相關(guān)性。(3)剪接基因GO分類。根據(jù)其分子學(xué)功能分類,這些發(fā)生可變剪接的基因主要涉及鐵離子結(jié)合、化學(xué)因子活性、基質(zhì)金屬蛋白酶活性及分子活性。而從生物學(xué)過程考慮,這些基因主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、趨化作用、MAPK活性的活化及抗凋亡等相關(guān)。(4)生物學(xué)路徑分析。以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析為基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)297個(gè)可變剪接基因中的95個(gè)與已知的生物學(xué)路徑相關(guān),并且鑒定出其中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的通路,包括細(xì)胞因子及其受體的相互作用、MAPK信號(hào)路徑、細(xì)胞黏

14、附分子、actin細(xì)胞骨架的調(diào)控、細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)路徑及自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒等。
　　 結(jié)論:單個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)生多個(gè)可變剪接事件,提示了小鼠體內(nèi)剪接調(diào)控模式的復(fù)雜性。發(fā)生可變剪接的基因與發(fā)生差異表達(dá)的基因相比,雖然重疊部分很少,但其GO歸類與生物學(xué)通路重疊比例很高,提示相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)受到轉(zhuǎn)錄表達(dá)與外顯子剪接兩個(gè)水平的共同調(diào)控。
　　 第三部分肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達(dá)基因及可變剪接的驗(yàn)證研究

15、r>　　 目的:驗(yàn)證在突變SOD1存在的情況下,G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的差異表達(dá)基因及可變剪接事件。
　　 方法:應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)發(fā)病G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩對(duì)照的腰髓組織中感興趣差異表達(dá)基因及可變剪接進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:發(fā)病動(dòng)物腰髓樣本中CD68抗原(CD68 antigen,CD68)與脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)的mRNA表達(dá)水平明顯增高(P＜0.001),提示在疾病

16、的早期階段存在炎癥反應(yīng)與脂類高代謝狀態(tài)。我們也對(duì)ALS中程序性細(xì)胞死亡1(programmed cell death1,PDCD1)mRNA轉(zhuǎn)錄本的可變剪接進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明包含外顯子2的異構(gòu)體主要存在于發(fā)病動(dòng)物,而不含外顯子2的異構(gòu)體主要存在于對(duì)照組。芯片預(yù)測(cè)發(fā)生可變剪接與不發(fā)生可變剪接的外顯子均通過RT-PCR得以證實(shí)。
　　 結(jié)論:上述結(jié)果證實(shí)了外顯子芯片技術(shù)的可靠性與敏感性,其可用以檢測(cè)基因水平及外顯子水平