噬菌體展示肽庫篩選成人骨細(xì)胞特異性結(jié)合多肽的實驗研究.pdf

1、以純化的人顱骨成骨細(xì)胞為陽性靶細(xì)胞,從噬菌體展示十二肽庫中篩選出能夠與之特異性結(jié)合的多肽,為鈦種植體表面的生物化修飾提供新的策略和研究方向。
　　第一部分:噬菌體展示十二肽庫篩選人成骨細(xì)胞特異性多肽的實驗研究
　　以人顱骨成骨細(xì)胞作為靶細(xì)胞,對噬菌體展示十二肽庫進行全細(xì)胞篩選,洗滌后將獲得的細(xì)胞洗脫液和細(xì)胞裂解液分別培養(yǎng)計數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計數(shù)平板中隨機挑選46個(洗脫、裂解各23個)分離良好的噬菌體克隆,以人牙齦成纖維細(xì)

2、胞為對照細(xì)胞進行細(xì)胞ELISA檢測、細(xì)胞免疫熒光等鑒定陽性噬菌體克隆并測序分析。
　　結(jié)果顯示:共得到22個與成骨細(xì)胞特異性結(jié)合力高于成纖維細(xì)胞2倍以上的陽性克隆,氨基酸序列具有同源性。洗脫、裂解液中獲得了共同的特異性結(jié)合多肽,比例相當(dāng),占有相近的結(jié)合優(yōu)勢,這也說明與成骨細(xì)胞具有高度親和力的噬菌體是通過其表面展示的短肽與細(xì)胞特異性結(jié)合,而能夠內(nèi)化入細(xì)胞胞漿內(nèi)的噬菌體也是通過這種受體介導(dǎo)的胞吞作用進行的。出現(xiàn)頻率最高的多肽氨基酸序列

3、為:MGWSWWPETWPM,對該多肽序列的氨基酸組成特點及其基本的生化特性進行分析。
　　第二部分:噬菌體展示十二肽庫全細(xì)胞差減篩選人成骨細(xì)胞特異性多肽的實驗研究
　　以人顱骨成骨細(xì)胞作為陽性靶細(xì)胞,人牙齦成纖維細(xì)胞為陰性吸附細(xì)胞,對噬菌體展示十二肽庫進行全細(xì)胞差減篩選,洗滌后將獲得細(xì)胞洗脫液培養(yǎng)計數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計數(shù)平板中隨機挑選30個噬菌體克隆,分別用人顱骨成骨細(xì)胞和人牙齦成纖維細(xì)胞進行細(xì)胞ELISA檢測、細(xì)胞免疫

4、熒光等鑒定陽性噬菌體克隆并測序分析。其中共得到18個與成骨細(xì)胞特異性結(jié)合力高于成纖維細(xì)胞2倍以上的陽性克隆,其中比值最高者為4.88,取該純化噬菌體樣品(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)進行細(xì)胞免疫熒光實驗。
　　結(jié)果顯示:表達(dá)該多肽(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)的噬菌體克隆可大量聚集結(jié)合在人成骨細(xì)胞表面,在細(xì)胞內(nèi)部呈現(xiàn)點簇狀聚集而發(fā)出綠色熒光,成纖維細(xì)胞綠色熒光暗淡。對該多肽序列的氨基酸組成特點及其基本的生化特性