丹酚酸A預(yù)處理對離體缺血——再灌注心臟和心肌細(xì)胞的保護作用.pdf

1、目的：本研究通過建立大鼠離體模擬缺血-再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)心臟和心肌細(xì)胞模型，觀察丹酚酸A(Salvianolic acid A, Sal A)對心功能、心肌壞死標(biāo)記物、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞存活率、單個心肌細(xì)胞的收縮功能、凋亡相關(guān)蛋白以及磷酸化Akt(phosphorylation of Akt, p-Akt)表達的影響，探討Sal A對I/R損傷的保護作用及其可能的分子機制。
　　 方

2、法：
　　 1．采用Langendorff離體心臟灌流模型，采用停灌、復(fù)灌方法模擬I/R過程，觀察Sal A對離體I/R心臟的保護作用。將平衡穩(wěn)定30min后的離體心臟分為：(1)對照組(Control,n=6)：離體心臟繼續(xù)用K-H液灌流160min;(2)I/R組(I/R,n=6)：離體心臟繼續(xù)用K-H液灌流10min，再進行停灌模擬缺血30min，再灌注120min；(3)丹酚酸A組(SalA,n=6)：離體心臟先用含丹酚

3、酸A(20μM)的K-H液預(yù)處理10min，再進行模擬缺血30min，再灌注120min。灌注過程中將一連接于壓力傳感器的充水水囊經(jīng)肺靜脈口進入左心房，經(jīng)二尖瓣插入左心室，以進入左室后LVEDP為5-15mmHg為充水水囊充水后標(biāo)準(zhǔn)，通過生物信號采集器測量心功能各項指標(biāo)。分別于缺血前、再灌注30min、120min記錄心率(HR)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓變化最大速率(±dp/dtmax)。同時各

4、組在再灌注15min時留取冠脈流出液待測乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)釋放量。再灌注結(jié)束后，TTC染色法測定各組心臟的心肌梗死面積。
　　 2．以常規(guī)酶解法分離成年大鼠心肌細(xì)胞，采用缺糖缺氧、復(fù)糖復(fù)氧的方法模擬I/R過程，觀察Sal A對離體I/R心肌細(xì)胞的保護作用。取分離所得心肌細(xì)胞，分為以下各組：(1)Control組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)18h或22h;(2)1/R組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)13h后，培養(yǎng)基更換為模擬缺血液，

5、再放入三氣培養(yǎng)箱中進行模擬缺氧培養(yǎng)3h，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為高糖DMEM培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱復(fù)糖復(fù)氧模擬再灌注；(3)Sal A不同濃度組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)1h后，加入不同濃度Sal A(0.1-10μM)預(yù)處理12h，再進行模擬I/R，方法同I/R組；為檢測心肌細(xì)胞p-Akt信號蛋白的表達，明確其與PI3K/Akt的關(guān)系，將分離的心肌細(xì)胞分為：(4)SalA+LY294002組：心肌細(xì)胞先加入LY294002(50μM)孵育1h

6、，再進行各濃度Sal A(1-10μM)預(yù)處理，隨后進行模擬I/R，方法同I/R組。再灌注時間根據(jù)不同指標(biāo)分為2h或6h。處理細(xì)胞分別進行以下實驗：用心肌細(xì)胞桿狀率評價細(xì)胞的存活率；用單個心肌細(xì)胞檢測技術(shù)測定心肌細(xì)胞收縮幅度；用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡率；用免疫印跡法(Westem blot)測定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Akt和p-Akt蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1．與Control組相比，在

7、離體器官水平上，模擬I/R能夠明顯地降低離體心功能的各種參數(shù)(P＜0.01)，增加冠脈流出液中LDH和CK的釋放量(P＜0.01)，增加心肌梗死面積(P＜0.01)；與I/組相比，Sal A預(yù)處理后可減輕心肌損傷，改善大鼠心功能(P＜0.01)，減少LDH和CK的釋放(P＜0.01)，減少心肌梗死面積(P＜0.01)。
　　 2．與Control組相比，在細(xì)胞水平上，模擬I/R能夠顯著降低心肌細(xì)胞存活率(P＜0.01)，降低心肌

8、細(xì)胞的收縮幅度(P＜0.01)；與I/組相比，不同濃度的Sal A預(yù)處理能夠不同程度地增加心肌細(xì)胞存活率(P＜0.01)，抑制細(xì)胞收縮幅度的降低(P＜0.01)，且呈劑量依賴性。
　　 3．與Control組相比，在細(xì)胞水平上，模擬I/R能夠顯著降低心肌細(xì)胞Bcl-2的表達(P＜0.01)，增加Bax、Caspase-3的表達(P＜0.01)，使得Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.01)，凋亡率明顯增加(P＜0.01)；與I/

9、R組相比，不同濃度的Sal A預(yù)處理能夠不同程度地增加Bcl-2的表達(P＜0.01)，減少Bax、Caspase-3的表達(P＜0.01),使得Bcl-2/Bax比值增加(P＜0.01)，凋亡率明顯減少(P＜0.01)。
　　 4．與Control組相比，在細(xì)胞水平上，模擬I/R能使心肌細(xì)胞p-Akt一定程度上增加(P＜0.05)；而丹酚酸A預(yù)處理后能夠使心肌細(xì)胞p-Akt顯著增加(與I/R組相比，P＜0.01)，用LY294

10、002阻斷PI3K后，則同樣濃度Sal A使p-Akt增加不明顯(與單純SalA組相比，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1．丹酚酸A預(yù)處理對離體大鼠缺血-再灌注損傷具有保護作用，能夠改善缺血-再灌注心臟的收縮功能，減少心肌細(xì)胞壞死，抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　 2．丹酚酸A預(yù)處理能夠增加心肌細(xì)胞Bcl-2的表達，減少Bax、Caspase-3的表達，使得Bcl-2/Bax比值增加，從而發(fā)揮抗凋亡作用。