妊娠早期絨毛和蛻膜組織差異蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、目的：胚胎成功植入依賴于子宮內(nèi)膜與胚胎之間的同步發(fā)育，二者同步化的真正物質(zhì)基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組相關(guān)技術(shù)，分析妊娠早期人胚胎絨毛和子宮蛻膜組織蛋白質(zhì)組，從蛋白質(zhì)整體水平探索胚胎植入的分子機(jī)制。 方法： 1、收集正常妊娠第6～10周人工流產(chǎn)的胚胎絨毛和子宮蛻膜組織，分別于-80℃凍存。 2、雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)分別分離絨毛和蛻膜組織蛋

2、白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)染色后，用PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析。 3、對12個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析酶切片斷，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，使用國際互聯(lián)網(wǎng)上Matrix Science公司提供的PMF鑒定程序(Mascot：Peptide Mass Fingerprint)進(jìn)行查詢，每個(gè)查詢得到一個(gè)分值(Mowse Score)，根據(jù)分值計(jì)算概率來評價(jià)每個(gè)檢索結(jié)

3、果。通?？山邮艿挠蛑凳牵阂粋€(gè)事件隨機(jī)發(fā)生的概率小于5％，則該事件為有意義(p<0.05)。 4、運(yùn)用RT-PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步分析和驗(yàn)證ANXA1mRNA和蛋白質(zhì)在妊娠早期絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、2-DE圖譜顯示，妊娠早期正常絨毛和蛻膜組織蛋白質(zhì)分子量(Mw)主要集中在18.4～116 kDa范圍內(nèi)，等電點(diǎn)(pI)主要分布在pH4.0～7.0之間。PDQue

4、st軟件分析圖像，測得正常絨毛和蛻膜組織凝膠的匹配率為45％。正常絨毛和蛻膜組織蛋白點(diǎn)分別約為680個(gè)和621個(gè)，大約60個(gè)蛋白點(diǎn)在二者間有3倍以上的量變，其中約33個(gè)蛋白點(diǎn)在正常絨毛組織中的表達(dá)量高于正常蛻膜組織3倍以上，27個(gè)蛋白點(diǎn)在正常蛻膜組織中的表達(dá)量高于正常絨毛組織3倍以上。 2、從60個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中隨機(jī)選取12個(gè)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，7個(gè)蛋白點(diǎn)獲得了有意義的結(jié)果(p<0.05)。分別為

5、膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1，ANXAl)、熱休克蛋白90β(Heat shock protein 90 kDa beta，HSP 90β)、載脂蛋白A-1前體(Apolipoprotein A-Ⅰ precursor，APOA1)、波形蛋白(Vimentin，VIME)、膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5，ANXA5)、原肌凝蛋白4(Tropomyosin-4，TPM4)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體(Protein disulf

6、ide-isornerase A3precursor，PDIA3)。 3、在12個(gè)差異候選蛋白點(diǎn)中，有5個(gè)蛋白點(diǎn)在正常絨毛組織中有較高表達(dá)，7個(gè)蛋白點(diǎn)在正常蛻膜組織中有較高表達(dá)。 4、RT-PCR結(jié)果顯示，正常絨毛組織ANXAlmRNA表達(dá)明顯高于正常蛻膜組。Westem Blot分析ANXA1蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果與RT-PCR一致。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，正常絨毛組織中ANXA1免疫染色黃褐色陽性物質(zhì)分布廣泛，特別是在

7、絨毛干滋養(yǎng)層細(xì)胞中，胞漿濃染。正常蛻膜組織也有ANXA1免疫染色陽性物質(zhì)積聚，分布在上皮細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞的胞漿中，染色比正常絨毛組織淺。 結(jié)論： 胚胎植入涉及諸多蛋白質(zhì)分子的參與以及蛋白質(zhì)問的相互作用。本實(shí)驗(yàn)從妊娠早期胚胎絨毛和子宮蛻膜組織差異蛋白質(zhì)組的研究中獲得初步結(jié)果，并鑒定出7個(gè)有意義的蛋白，分別是膜聯(lián)蛋白A1、膜聯(lián)蛋白A5、原肌凝蛋白4、熱休克蛋白90β、載脂蛋白A-1前體、波形蛋白和二硫鍵異構(gòu)酶A3前體。這些蛋白