Stathmin基因RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)骨肉瘤LM8細(xì)胞系相關(guān)生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：Stathmin siRNA表達(dá)載體構(gòu)建及干擾效果鑒定
　　 背景與目的：RNAi是轉(zhuǎn)錄后基因沉默，其作為一種高效的基因敲除工具，能有效調(diào)節(jié)有機(jī)體和細(xì)胞特定基因的表達(dá)，其為人類腫瘤的基因治療提供了廣闊的臨床應(yīng)用前景。構(gòu)建stathmin基因RNA干擾真核表達(dá)質(zhì)粒載體，并觀察其轉(zhuǎn)染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細(xì)胞系前后stathmin基因表達(dá)的變化。
　　 方法：根據(jù)GenBank中

2、stathmin（小鼠）序列，設(shè)計(jì)針對(duì)stathmin基因編碼區(qū)的寡核苷酸鏈，體外退火后克隆入經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ 雙酶切線性化的干擾質(zhì)粒載體pGenesiL-1中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析和DNA序列測(cè)定。以脂質(zhì)體法將3個(gè)重組質(zhì)粒（pGenesiL-1-stathmin1、pGenesiL-1-stathmin2和pGenesiL-1-HK）分別轉(zhuǎn)染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細(xì)胞系。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后G418篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。研究的細(xì)胞

3、分5組：C1組LM8細(xì)胞空白對(duì)照(命名LM8空白)；C2組LM8細(xì)胞+脂質(zhì)體(命名LM8脂質(zhì)體)；C3組轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA HK質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-HK);C4轉(zhuǎn)染特異性的siRNA stathmin1質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-stathmin1)；C5組轉(zhuǎn)染特異性的siRNA stathmin2質(zhì)粒(命名pGenesiL-1-stathmin2)。然后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組LM8細(xì)胞系stathmin Mr

4、na的表達(dá)，Western blotting 技術(shù)檢測(cè)stathmin基因在蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及DNA 測(cè)序，重組質(zhì)粒中成功插入了目的基因片斷。pGenesiL-1-stathmin1和pGenesiL-1-stathmin 2轉(zhuǎn)染C3h鼠源性骨肉瘤LM8細(xì)胞系后，均明顯抑制了stathmin Mrna 及其蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)stathmin RNA干擾質(zhì)粒表達(dá)載體pGenes

5、iL-1-stathmin1和pGenesiL-1-stathmin2，它們均能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8細(xì)胞系的表達(dá)。這為stathmin基因應(yīng)用于骨肉瘤的治療研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第二部分：Stathmin-siRNA對(duì)骨肉瘤LM8細(xì)胞系相關(guān)生物學(xué)行為的影響
　　 背景與目的：Stathmin在多種惡性腫瘤細(xì)胞中都有高水平表達(dá)，通過抑制其表達(dá)可以明顯干擾惡性腫瘤細(xì)胞的分裂，影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋

6、亡。本研究觀察已構(gòu)建的靶向stathmin基因RNA干擾質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染LM8細(xì)胞系后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：將已構(gòu)建的靶向stathmin干擾質(zhì)粒pGenesiL-1-stathmin和通用對(duì)照質(zhì)粒pGenesiL-1-HK，以脂質(zhì)體法將2個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤LM8細(xì)胞系。臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，MTT(噻唑藍(lán))法比色分析檢測(cè)細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制率；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察單個(gè)細(xì)胞體外增殖活力；細(xì)胞HE染色

7、觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡特征并計(jì)算凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)定量分析細(xì)胞周期的變化；C3H小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤細(xì)胞的成瘤能力。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建的pGenesiL-1-stathmin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LM8細(xì)胞后，明顯抑制了細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制率顯著增加；單個(gè)細(xì)胞體外增殖活力顯著下降；細(xì)胞HE染色部分細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；Hoechst染色顯示細(xì)胞凋亡特征，細(xì)胞凋亡率明顯增高；流式細(xì)胞

8、術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,比率明顯增高；C3H小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示特異轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞致瘤率下降，腫瘤生長(zhǎng)減緩。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建的靶向干擾質(zhì)粒pGenesiL-1-stathmin能明顯影響骨肉瘤LM8細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為。其有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，這為把stathmin基因應(yīng)用于骨肉瘤的基因治療研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分：Stathmin基因沉默協(xié)同增效泰索帝對(duì)骨肉瘤細(xì)胞化療作用的實(shí)驗(yàn)研究

9、
　　 背景與目的: Stathmin蛋白是至關(guān)重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，其促進(jìn)微管解聚，阻斷細(xì)胞有絲分裂紡錘體形成從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。泰索帝抗腫瘤化療藥是通過促進(jìn)微管聚合，從而導(dǎo)致紡錘體功能障礙及細(xì)胞的凋亡。本研究探討stathmin基因沉默協(xié)同增效泰索帝對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的化療敏感性。
　　 方法：將已構(gòu)建成功的針對(duì)stathmin Mrna的siRNA真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LM8骨肉瘤細(xì)胞并獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。泰索帝和順鉑分別誘導(dǎo)對(duì)照

10、組LM8細(xì)胞﹑轉(zhuǎn)染的LM8細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定以上二組細(xì)胞的生長(zhǎng)，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察二組細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞體外增殖活力，MTT(噻唑藍(lán))法分別檢測(cè)泰索帝和順鉑對(duì)二組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度，流式細(xì)胞術(shù)定量分析泰索帝對(duì)二組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，不同濃度的泰索帝和順鉑均抑制了LM8細(xì)胞的生長(zhǎng)，但泰索帝對(duì)轉(zhuǎn)染的LM8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用尤為明顯；泰索帝較順鉑更加明顯減少了單個(gè)細(xì)胞，特別是轉(zhuǎn)染LM8骨肉瘤細(xì)胞體