靶向Livin基因沉默對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生物學(xué)行為影響及作用機制的實驗研究.pdf

1、目的：Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitorsofapoptosisproteins，IAPs）中的一個最新成員，其主要在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要的作用。降低或消除Livin基因在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)，可解除Livin對腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低目的基因的表達(dá)，并已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本研究旨在采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，觀察

2、其對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480增殖凋亡的影響，并初步探討Livin基因在結(jié)腸癌中的作用，為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的耐藥性及基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：①設(shè)計并制備針對Livin基因的小干擾RNA序列，以脂質(zhì)體（lipofectamineTM2000）為載體轉(zhuǎn)染具有高侵襲潛能低分化人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率，尋求SW480細(xì)胞株的最佳轉(zhuǎn)染效率的條件；②將Livin-siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，分別采

3、用RT-PCR以及Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞Livin和Caspase-3在mRNA和蛋白水平表達(dá)情況；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測不同時間段細(xì)胞增殖活性的變化，并繪制生長曲線。③采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測計算對照組和實驗組細(xì)胞的吸光度值以及細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果：①細(xì)胞數(shù)約為每孔1.2x105個，siRNA為80pmol，Lipofectamine2000與siRNA比例為4ul:4ul(6

4、孔板)時，具有較佳的轉(zhuǎn)染效率(93.9％)，繼續(xù)提高siRNA濃度并不能明顯提高轉(zhuǎn)染效率；②轉(zhuǎn)染Livin-siRNA后轉(zhuǎn)染組LivinmRNA和蛋白表達(dá)明顯下降，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，顯示出較佳的干擾效果；而Caspase-3mRNA的表達(dá)和蛋白的活性卻得到增強，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。③轉(zhuǎn)染了Livin-siRNA的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，凋亡增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(

5、p＜0.05)，但對其細(xì)胞周期未見明顯影響，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：①Livin-siRNA能有效沉默結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中Livin基因的過表達(dá)；②Livin基因通過Caspase蛋白酶水解途徑來調(diào)控SW480細(xì)胞的生長；③Livin-siRNA轉(zhuǎn)染可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖并且能加速其凋亡，但可能不通過影響細(xì)胞周期來發(fā)揮作用。靶向RNAi干擾技術(shù)在結(jié)腸癌的基因治療中具有潛在的價值，Livin

6、可作為結(jié)腸癌基因治療的新靶點。
　　 結(jié)腸癌(colorectalcancer，CRC)作為臨床上最常見的一種惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例約120萬例，居全世界癌癥病人發(fā)病率中的第四位[1]，并且以2%的速度不斷遞增，其中約有63萬例死亡。從微觀上講，結(jié)腸癌的演變是一個多階段、多基因、多水平的復(fù)雜分子病理模擬機制，但其真正的病因及機制到目前為止還沒有相關(guān)文獻(xiàn)做出過明確報道[2-3]。目前許多研究均證實了多數(shù)結(jié)腸癌的發(fā)生都會經(jīng)歷“

7、正常黏膜—腺瘤—癌癥”這一過程[4-5]，細(xì)胞凋亡和增殖的失衡是導(dǎo)致結(jié)腸癌的一個重要原因，不斷探索結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡阻滯調(diào)節(jié)機制，可以為結(jié)腸癌的臨床治療策略的建立及治療方案的確定提供有效的分子理論基礎(chǔ)。凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAPs)是一類高度保守的、細(xì)胞內(nèi)源性抗凋亡基因產(chǎn)物，能夠保護特定的細(xì)胞抵抗相應(yīng)刺激源所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，于上世紀(jì)90年代初由crook等[6]在桿狀病毒Cydiapom

8、onella顆粒體和Orgiapseudotsugatahe核多角病毒的研究中首次分離得到。Livin基因則是凋亡抑制蛋白家族中的最新成員之一，是一種重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子。國內(nèi)外的學(xué)者通過不同的技術(shù)手段在體內(nèi)外檢測發(fā)現(xiàn)Livin基因在眾多腫瘤細(xì)胞株以及原發(fā)腫瘤組織中均表達(dá)異常增高，相反在大部分正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)[7]，因此科學(xué)家們認(rèn)為Livin基因的發(fā)現(xiàn)是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一個里程碑式發(fā)現(xiàn)，有可能成為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的一個新的靶向分子