IL-1β、HIF-α和VEGF在兔骨性關(guān)節(jié)炎模型的滑膜中的表達(dá).pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎是中老年人最常見(jiàn)的疾病之一，由于人群預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也明顯增高，尤其是肥胖的老年人群，60歲以上人群中，50％以上在X線上有骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。其常見(jiàn)病理改變?yōu)檐浌窍鹿怯不㈥P(guān)節(jié)周圍骨贅形成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。健康的軟骨組織是一種無(wú)血管、神經(jīng)、淋巴管的結(jié)締組織，關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)及供氧主要通過(guò)關(guān)節(jié)滑液及軟骨下骨中取得。而整個(gè)關(guān)節(jié)是處于一種生理性低氧環(huán)境之中。既往研究顯示關(guān)節(jié)滑液

2、中的氧分壓僅為6.65-7.98Kpa，表層軟骨含氧量為7％-10％，隨著深度增大這種缺氧不斷增加，深層軟骨含氧量?jī)H為1％。正常情況下，這種低氧環(huán)境對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的正常生理功能具有重要意義。骨性關(guān)節(jié)炎病變時(shí)，某些細(xì)胞因子及蛋白如TNF-a，IL-1，IL-17促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的增生，導(dǎo)致滑膜增殖，當(dāng)滑膜組織的增殖速度超過(guò)想對(duì)應(yīng)的血管增生的速度，以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓力升高進(jìn)一步減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)的供血，導(dǎo)致滑膜關(guān)節(jié)內(nèi)缺氧會(huì)進(jìn)一步加重，yudoh k及他

3、的同事研究發(fā)現(xiàn)，這時(shí)的軟骨表面的氧含量為3％-8％，在缺氧加重的條件下，許多種細(xì)胞內(nèi)PHD-2、PHD-3顯著增加，從而促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)基因表達(dá)增加。
　　 HIF-1是一種在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮作用的核轉(zhuǎn)錄因子(NF)，是在進(jìn)行低氧誘導(dǎo)的紅細(xì)胞生成素(EPO)基因表達(dá)的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白。它是由HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成的異源二聚體，HIF-1α是bHLH-PAS蛋白家族中的一員，由于其結(jié)構(gòu)中較HIF-

4、1β多了一個(gè)氧依賴降解區(qū)域(ODD)，因此HIF-1β是HIF-1調(diào)節(jié)缺氧中特有亞基。關(guān)節(jié)缺氧情況加重時(shí)，細(xì)胞漿內(nèi)堆積的HIF-1α轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，并與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)DNA結(jié)合導(dǎo)致VEGF表達(dá)增高，VEGF是目前公認(rèn)的一種促血管生成的因子，它導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，或者通過(guò)環(huán)氧化酶-2(cox-2)等直接導(dǎo)致血管增生。在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用的同時(shí)，β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽同時(shí)發(fā)揮它們促神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，這些新生的神經(jīng)是沿著血

5、管而生長(zhǎng)，最終與新生血管一起，插入未骨化的軟骨、半月板以及新生的骨贅之中。新生的血管雖然在某種程度上改善了關(guān)節(jié)中的供氧，但卻同時(shí)促進(jìn)了滑膜炎癥的浸潤(rùn)，而新生的神經(jīng)可能加重骨性關(guān)節(jié)炎的疼痛癥狀。
　　 既往對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的研究，主要是針對(duì)軟骨及軟骨下骨。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)慢性滑膜炎在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。在取行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)及關(guān)節(jié)置換的骨性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎患者從發(fā)病早期到必須行關(guān)節(jié)置換手術(shù)的

6、疾病晚期都伴隨有慢性滑膜炎改變。滑膜炎發(fā)生時(shí)，滑膜細(xì)胞分泌多種促炎因子和細(xì)胞因子，介導(dǎo)下游因子參與軟骨的破壞作用，IL-1β是這一過(guò)程中最重要的炎癥因子之一，在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用，它主要由CD14+滑膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞分泌PGE2（前列腺素E2）及其他炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)滑膜炎癥，誘導(dǎo)骨吸收。IL-1β加入體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中，可激活誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)產(chǎn)生大量的NO，NO作為IL-1β的

7、下游產(chǎn)物，是IL-1β作用于軟骨的主要效應(yīng)分子，IL-1β從Fas途徑對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生明顯影響。IL-1β與TNF-α能與各自的細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活炎癥信號(hào)通路，最終激活核因子κB(NF-κB)，NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以由壓力有關(guān)的刺激，包括過(guò)度的機(jī)械應(yīng)力和ECM的降解產(chǎn)物。一旦被激活，NF-κB的調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子，趨化因子，粘附分子，炎癥介質(zhì)，和幾個(gè)基質(zhì)降解酶MMPs的表達(dá)。MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，廣泛存在

8、于結(jié)締組織中，對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分中的Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖具有高度的裂解活性，既往研究顯示，IL-1β能促進(jìn)MMP-13、3 mRNA在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，抑制Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的合成，IL-1β還能促進(jìn)MMP-1、3的合成代謝，通過(guò)降解Ⅱ型膠原蛋白，達(dá)到破壞關(guān)節(jié)軟骨的目的。IL-1β還能夠上調(diào)HIF-1α蛋白水平，上調(diào)下游基因VEGF的表達(dá)，促進(jìn)滑膜組織中血管增殖，進(jìn)而促進(jìn)炎癥浸潤(rùn)。
　　 本研究利用木瓜蛋白酶行兔膝關(guān)節(jié)腔

9、注射進(jìn)行骨性關(guān)節(jié)炎模型制造，完成造模后切取膝關(guān)節(jié)中滑膜組織，采用ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達(dá)和采用Western blot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達(dá)，以探討IL-1β、HIF-1α、VEGF的表達(dá)與OA之間的關(guān)系。
　　 HIF-1α在兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型滑膜組織中表達(dá)
　　 研究目的:
　　 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝關(guān)節(jié)腔注射制造兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎

10、模型。
　　 2、觀察造模后不同時(shí)期兔膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨的表現(xiàn)，并切取滑膜組織保存。
　　 3、采用Western blot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達(dá)并探討其意義。
　　 材料和方法:按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將30只雄性新西蘭大白兔分為6組(實(shí)驗(yàn)組A1、A2、A3;對(duì)照組B1、B2、B3)，每組5只，共10個(gè)膝關(guān)節(jié)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組A1、A2、A3分別于第1、4、7天以1.6％木瓜蛋白酶行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射制造兔

11、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，予對(duì)照組B1、B2、B3分別于第1、4、7天以生理鹽水行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射作為對(duì)照。并分別在注射完成后2周、4周、6周后使用氣體栓塞法分別處死A1B1.、A2B2、A3B3組動(dòng)物，切開(kāi)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)，觀察造模后2、4、6周后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜增生及軟骨退變情況，切取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，迅速置于液氮瓶中，并最終置于-80℃的冰箱內(nèi)保存，待6周后，滑膜標(biāo)本采集完畢，將滑膜組織自冰箱內(nèi)取出，加入組織裂解液后迅速研磨成勻漿液，采用West

12、ern blot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達(dá)。
　　 結(jié)果:對(duì)照組B1、B2、B3組兔膝關(guān)節(jié)無(wú)腫脹、充血，關(guān)節(jié)液透明，滑膜組織無(wú)水腫、無(wú)肥厚，關(guān)節(jié)軟骨半透明光滑，呈淡藍(lán)色;A1、A2、A3組兔膝關(guān)節(jié)腫脹、充血明顯關(guān)節(jié)液呈淡黃色渾濁狀態(tài)，A1組滑膜組織稍增厚，關(guān)節(jié)面粗糙，關(guān)節(jié)軟骨色澤狄暗，呈現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎早期表現(xiàn);A2組滑膜明顯增厚關(guān)節(jié)面軟骨色澤灰暗、潰瘍形成，呈現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎中期表現(xiàn);A3組滑膜最厚，滑膜組織與

13、股骨粘連嚴(yán)重，軟骨缺損明顯，部分軟骨剝脫軟骨下骨質(zhì)暴露，呈現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎晚期表現(xiàn)。模型組A1、A2、A3組滑膜中HIF-1α的表達(dá)分別與對(duì)照組B1、B2、B3組比較，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組（均P＜0.01）;模型組A1、A2、A3組滑膜中HIF-1α的表達(dá)差異有顯著性，A1組＜A2組、A2組＜A3組(均P＜0.05)。
　　 結(jié)論:造模后不同時(shí)期，兔膝關(guān)節(jié)表現(xiàn)出骨性關(guān)節(jié)炎早期、中期、晚期的表現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)滑膜逐

14、漸增厚，HIF-1α因子表達(dá)與膝關(guān)節(jié)滑膜增殖程度呈正相關(guān)，HIF-1α的差異表達(dá)與骨性關(guān)節(jié)炎退變有關(guān)。
　　 木瓜蛋白酶IL-1β、VEGF在兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型滑膜組織中表達(dá)研究
　　 目的:
　　 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝關(guān)節(jié)腔注射制造兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。（與檢測(cè)HIF-1α蛋白來(lái)自相同的動(dòng)物模型中）
　　 2、采用ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達(dá)并探討其意義。

15、
　　 材料和方法:造模方式與檢測(cè)HIF-1α蛋白時(shí)相同，切取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入緩沖液后研磨成勻漿分裝后迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫龢?biāo)本完全備齊，將冷凍的滑膜組織取出，采用ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達(dá)。
　　 結(jié)果:模型組A1、A2、A3組滑膜中IL-1β、VEGF的表達(dá)分別與對(duì)照組B1、B2、B3組比較，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組（均P＜0.01）;模型組