新化合物體外抗腫瘤活性及作用機(jī)制.pdf

1、腫瘤是當(dāng)今世界的一大難題，腫瘤發(fā)病率、死亡人數(shù)持續(xù)走高，其治療仍迫切需要更有效的藥物。微管蛋白抑制劑是一類作用于微管蛋白并破壞其動(dòng)態(tài)平衡，從而阻止腫瘤細(xì)胞增殖的抗癌藥物，在臨床多種實(shí)體腫瘤治療中處于重要的地位。新型微管靶向抗腫瘤藥物因具有明確的分子靶向性、強(qiáng)效的抗腫瘤以及抑制并破環(huán)腫瘤新生血管形成的作用，成為抗腫瘤藥物研究的新熱點(diǎn)。WX-123-27，WX-127-07，WX-132-18B是由本所通過(guò)普篩發(fā)現(xiàn)的三個(gè)具有極強(qiáng)抗腫瘤活性的

2、新型分子，初步的實(shí)驗(yàn)表明該類化合物可能作用于微管蛋白[1]。
　　本課題采用本課題組建立的基于高內(nèi)涵分析(HCA)的抗腫瘤藥物藥效及機(jī)制研究的技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)系統(tǒng)、高效的體外實(shí)驗(yàn)，確定上述三種新化合物的抗腫瘤活性及作用的分子機(jī)制，以便在藥物發(fā)展早期階段全面了解這些活性分子的藥理學(xué)作用特征，為該類化合物的進(jìn)一步發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
　　在實(shí)驗(yàn)研究中以已知的微管靶向藥物為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用SRB法在HepG2，HeLa，A549，HLF

3、及HUVEC細(xì)胞上檢測(cè)了受試化合物的細(xì)胞增殖抑制活性;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期阻滯作用;通過(guò)高內(nèi)涵細(xì)胞毒性、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡的多參數(shù)分析以及與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路（包括2個(gè)GPCRs，6個(gè)核受體、2個(gè)生長(zhǎng)因子受體和激酶、7個(gè)細(xì)胞周期及DNA損傷、6個(gè)炎性及應(yīng)激和8個(gè)腫瘤非相關(guān)的通路）的篩查分析受試化合物的細(xì)胞效應(yīng)特征;最后采用秋水仙堿/熒光長(zhǎng)春堿的微管蛋白競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)和胰酶消化微管蛋白實(shí)驗(yàn)在分子水平確證受試化合物的微管蛋白作用位點(diǎn)。<

4、br>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: WX-123-27，WX-127-07，WX-132-18B在HepG2，HeLa，A549，HLF及HUVEC細(xì)胞上均具有顯著的細(xì)胞增殖抑制活性，WX-123-27的IC50分別為6.83±0.15 nM，6.72±0.19 nM，6.78±0.31 nM，5.51±0.11 nM，5.37±0.20nM，WX-127-07的IC50分別為4.47±0.05 nM，5.18±0.08 nM，4.90±0.19

5、 nM，4.10±0.16 nM，5.04±0.08 nM，WX-132-18B的IC50分別為1.03±0.02 nM，1.01±0.01nM，1.03±0.06 nM，0.86±0.02 nM，0.76±0.04 nM，作用強(qiáng)度顯著強(qiáng)于秋水仙堿（IC50分別為21.17±1.22 nM，14.19±0.53 nM，43.80±1.64 nM，145.89±10.97 nM，27.67±1.79 nM）和長(zhǎng)春新堿（IC50分別為16.

6、51±0.36 nM，16.76±0.33 nM，27.80±2.75 nM,43.80±1.48 nM,9.15±0.78 nM），在HepG2,HeLa、HLF細(xì)胞上作用顯著強(qiáng)于紫杉醇(IC50分別為10.68±0.61 nM，12.86±0.25 nM，102.07±15.17Nm)，在A549，HUVEC上作用與紫杉醇相當(dāng)(IC50分別為4.81±0.61 nM，3.04±0.12nM);高內(nèi)涵細(xì)胞多參數(shù)分析顯示，與紫杉醇濃度依

7、賴性地誘發(fā)A549細(xì)胞微管聚合不同，三種受試化合物與長(zhǎng)春新堿、秋水仙堿相似，濃度依賴地誘發(fā)A549細(xì)胞的微管解聚，紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、秋水仙堿、WX-123-27、WX-127-07、WX-132-18B使微管含量（以亮度和面積的乘積為指標(biāo)）改變的EC50分別為75.84nM，293.2 nM，105.5 nM，25.91 nM，17.31 nM，9.43 nM，即三種受試化合物的微管效應(yīng)顯著強(qiáng)于三種對(duì)照藥物;與三種陽(yáng)性對(duì)照藥物相似，三種

8、受試化合物誘發(fā)A549細(xì)胞在G2/M期阻滯，正常對(duì)照組細(xì)胞在G0/G1，S，G2/M期的分布分別為71.74％，21.95％，6.31％，經(jīng)紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、秋水仙堿、WX-123-27、WX-127-07、WX-132-18B作用后，G0/G1期比例明顯減少，分別為18.17％，11.63％，19.15％，7.41％，5.62％，3.74％，而G2/M期比例明顯增高，分別為62.90％，71.33％，63.61％，80.35％，72.

9、06％，83.80％;同樣，與三種陽(yáng)性對(duì)照藥物相似，受試化合物使HepG2細(xì)胞核膜通透性增加、誘導(dǎo)細(xì)胞早凋;在較高的濃度下，誘導(dǎo)輕度的Rad51顆粒的形成（約為陽(yáng)性藥喜樹(shù)堿的1/4），但未對(duì)篩查的其它30種信號(hào)通路有影響。在微管蛋白位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，WX-123-27，WX-127-07，WX-132-18B濃度依賴地抑制秋水仙堿與微管蛋白的結(jié)合（IC50分別為1.75±0.54μM，1.28±0.08μM，0.47±0.10μM）

10、，僅WX-123-27，WX-127-07在高濃度對(duì)熒光長(zhǎng)春堿與微管蛋白的結(jié)合表現(xiàn)出一定的抑制作用，但顯著弱于長(zhǎng)春新堿，也不能排除高濃度非特異的抑制作用;微管蛋白經(jīng)胰酶消化后的SDS蛋白電泳實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)X-123-27、WX-127-07、WX-132-18B與微管蛋白作用后的酶解產(chǎn)物與秋水仙堿作用較為相似而不同于長(zhǎng)春新堿，進(jìn)一步證明受試化合物主要作用于微管的秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)。
　　綜合以上的研究結(jié)果可以看出，受試化合物WX-123