慢性乙型肝炎病毒感染者家系隱匿性乙型肝炎病毒感染的調(diào)查研究.pdf

1、背景：在慢性HBV攜帶者的血清中通常存在HBsAg，它被認(rèn)為是急性和慢性HBV感染的標(biāo)志。然而，在一些患者，盡管在肝臟和外周血內(nèi)存在病毒，但常規(guī)的血清學(xué)檢測方法卻檢測不到這個抗原，亦即隱匿性HBV感染，是指血清HBsAg陰性，而血清或肝臟組織HBV DNA陽性。這種特殊形式感染可發(fā)生于抗-HBs和/或抗-HBc陽性的患者，也可見于乙肝五項檢測全為陰性的個體。目前關(guān)于隱匿性HBV感染者不同人群中的發(fā)生率尚無確切的定論，關(guān)于其在慢性HBV感

2、染者家系成員中的發(fā)生率報道亦不一致。通常這種特殊形式感染的病毒復(fù)制和基因表達(dá)水平非常低，但對引起這種情況的原因大部分是不清楚的。許多方法試圖找出這種特殊形式感染的機(jī)制。有兩種機(jī)制，一是這種抗原在外周血確實不存在，另一個是它存在于外周血中但沒有被檢測到。第一種機(jī)制可能是由于基因突變阻礙了抗原的輸出，例如前S區(qū)特定位點的缺失。第二種機(jī)制是HBsAg雖然存在但標(biāo)準(zhǔn)的酶鏈免疫法卻檢測不到，可能是由于HBsAg與抗-HBs之間形成了循環(huán)免疫復(fù)合物

3、減弱甚至完全抑制了抗原的檢測。許多研究認(rèn)為病毒低水平復(fù)制是外周血HBsAg陰性的主要原因，而有些研究卻認(rèn)為基因突變，尤其是HBV S區(qū)基因突變是引起隱匿性感染的主要原因，我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，對隱匿性HBV感染應(yīng)該引起高度重視。
　　 目的：研究慢性HBV感染者家系成員隱匿性HBV感染的發(fā)生率，并探討其與研究對象年齡、性別、生化學(xué)檢測結(jié)果以及乙型肝炎病毒標(biāo)志物之間的關(guān)系，同時采用隱匿性HBV感染者的一級HBsAg陽性親屬作為對照

4、，從S基因變異角度探討隱匿性HBV感染可能的分子機(jī)制。
　　 方法：（1）病例選擇和標(biāo)本收集：病例選擇的標(biāo)準(zhǔn)為：患者為確診的慢性HBV感染者，所有的家系成員均未接種過乙肝疫苗。2007年12月至2009年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及六安市人民醫(yī)院感染科住院部和門診部共收集了89例慢性HBV感染者，對其及其家系成員進(jìn)行病史采集并收集血清標(biāo)本，保存待檢。（2）病毒DNA模板制備：采用經(jīng)典的蛋白酶K消化-酚-氯仿方法。（3）引物

5、設(shè)計：參考國內(nèi)外文獻(xiàn)及HBV參照序列，在HBV基因組S、C、X區(qū)分別設(shè)計一對巢式引物。（4）巢式PCR擴(kuò)增，兩個區(qū)同時陽性者定義為隱匿性HBV感染者，并計算慢性HBV感染者家系成員隱匿性HBV感染的發(fā)生率。（5）根據(jù)HBV參照序列，在S區(qū)設(shè)計引物，對HBV 兩個區(qū)同時陽性者以及S區(qū)重復(fù)PCR陽性者進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)可能和HBV隱匿性感染有關(guān)的變異位點。同時對隱匿性HBV感染者的HBsAg陽性一級親屬進(jìn)行測序，并比較其與隱匿性HBV感染之間的

6、關(guān)系。
　　 結(jié)果：（1）在89例慢性HBV感染者家系成員共篩查到220例HBsAg陰性者，其中，151例抗-HBs陽性，44例抗-HBc陽性，33例抗-HBs和抗-HBc全陽者，56例抗-HBs和抗-HBc全陰者。220例樣本全部進(jìn)行了HBV S、C、X區(qū)的巢式PCR檢測，其中3個區(qū)同時陽性者有5例，兩個區(qū)同時陽性者20例，S區(qū)單獨陽性者3例。因3例S區(qū)單獨陽性者在后續(xù)的測序試驗中測序成功，把其也作為隱匿性HBV感染者，因此，

7、在本研究中隱匿性HBV感染的發(fā)生率約為12.7％。將28例隱匿性HBV感染者和192例HBsAg陰性、HBV DNA陰性者的一般情況及血清學(xué)和生化學(xué)檢測結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，兩者的性別、年齡和生化學(xué)檢測結(jié)果并不能區(qū)分隱匿性HBV感染者和非感染者，且發(fā)現(xiàn)在抗-HBc陽性者，隱匿性HBV感染的發(fā)生率更高(25.0％)，說明在既往有HBV感染史的患者，隱匿性HBV感染的發(fā)生率較高。（2）因其中一個標(biāo)本為C區(qū)和X區(qū)同時陽性，沒有進(jìn)行小S區(qū)的測序，因此

8、只有27個測序結(jié)果。在本研究的隱匿性HBV感染者和陽性對照共檢測到了2種基因型（HBV/B,HBV/C），其中HBV/B占優(yōu)勢，但將隱匿性HBV感染者和陽性對照相比較，兩者的基因型分布并無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.975，P=0.16）。通過測序發(fā)現(xiàn)，部分隱匿性HBV感染者（29.6％）在小S區(qū)不存在基因突變，而部分隱匿性HBV感染者則存在較多的基因突變（≥3個，25.9％），且有2例隱匿性HBV感染者提前形成終止密碼子，形成縮短的氨基酸序

9、列。與隱匿性HBV感染者相比，大部分（90％）陽性對照都存在基因突變，且隱匿性HBV感染者與陽性對照基因變異位點大部分不一致。而且，B基因型和C基因型隱匿性HBV感染者和陽性對照基因變異分布情況有明顯差異，在B基因型，隱匿性HBV感染者變異較集中在小S基因的中間部位，而陽性對照基因變異較集中在小S基因的兩邊，且在B基因型隱匿性HBV感染者，W156L變異較常見（35.71％）。而在C基因型，其基因變異情況與B基因型不同，其基因變異分布于

10、整個小S基因，而陽性對照基因變異分布則相對較集中，且在隱匿性HBV感染者，I68T（30.77％）和I126T（30.77％）變異較常見。
　　 結(jié)論：在慢性HBV感染者家系成員隱匿性HBV感染的發(fā)生率約為12.7％，且在抗-HBc陽性的研究對象隱匿性HBV感染的發(fā)生率較高（25.0％）。在一小部分隱匿性HBV感染者其小S區(qū)不存在基因突變，而大部分陽性對照都存在基因突變。將隱匿性HBV感染者和陽性對照相比較，發(fā)現(xiàn)兩者的基因變異分