BDE-209對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增殖分化及凋亡的影響.pdf

1、背景：
　　 1.關(guān)于PBDEs
　　 多溴聯(lián)苯醚是溴代類化合物，常作為阻燃劑加到油漆，塑料，紡織，電子電器等人造產(chǎn)品中，目前已廣泛應(yīng)用于電子、電腦和泡沫等家具中。自20世紀70年代生產(chǎn)和使用多溴聯(lián)苯醚至今，已造成多溴聯(lián)苯醚的全球性環(huán)境污染。有資料顯示,發(fā)達國家80％的電子垃圾進入中國、印度和巴基斯坦等國,其中中國又占了90％，導(dǎo)致城市的戶外空氣中PBDEs濃度比農(nóng)村空氣中的10倍還多,在我國一些地區(qū)已形成了電子垃圾拆解

2、集散地,原始的拆解手段使PBDEs等持久性有毒污染物不斷向周圍釋放,嚴重污染了當?shù)丨h(huán)境,危害人體健康.
　　 由于PBDEs具有難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性和生物放大作用，能夠通過食物鏈的轉(zhuǎn)移，使生物受到毒害，最終導(dǎo)致對人體健康的危害。研究表明，20世紀80年代初以來，環(huán)境中和人母乳中多溴聯(lián)苯醚不斷以指數(shù)形式增加，這與全球PBDEs需求的增長是一致的。PBDEs 在環(huán)境中能穩(wěn)定存在，并可沿著食物鏈傳播,最終通過食物、母乳、大氣

3、和室塵等蓄積在人體內(nèi).目前研究認為，PBDEs進入機體后多數(shù)積累在脂肪組織，對機體健康產(chǎn)生不良影響。PBDEs在鼠類脂肪組織中的半衰期為19-119天，含溴越多的PBDEs同系物,半衰期越長。
　　 多溴聯(lián)苯醚對試驗動物有致癌性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾毒性，因此,在美國及歐洲等地，相繼限制生產(chǎn)和使用低溴類如BDE-47,99,153等，但高溴類如BDE-209因其阻燃性好，其生物毒性不確定而仍在廣泛使用。人們對PBDEs

4、 毒性的了解遠不如PCBs。目前，實驗室研究證據(jù)積累相對較多，而人群研究對象主要是職業(yè)人群，數(shù)據(jù)相對缺乏。不同職業(yè)的人群中PBDEs 同系物的分布不完全相同。對荷蘭，美國，瑞士及中國人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品中，非職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-153，職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-209和BDE-183。
　　 2.關(guān)于BDE-209
　　 十溴聯(lián)苯醚是一種含有十個溴原子的多溴聯(lián)苯醚，具有穩(wěn)定性好，添加量少，價格便宜等優(yōu)勢

5、，據(jù)統(tǒng)計2001年十溴聯(lián)苯醚在所有PBDEs中使用占83.3％，十溴聯(lián)苯醚排放到環(huán)境中后，經(jīng)光解、高溫分解、生物及微生物降解等過程，會轉(zhuǎn)化為多溴二苯并二惡英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的聯(lián)苯醚，更容易進入生物體，引起更強的毒性作用。試驗也證明BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性，免疫毒性，內(nèi)分泌毒性以及致癌性等。
　　 3.關(guān)于神經(jīng)干細胞
　　 新記憶的形成，舊記憶的回想，學(xué)習能力的建立都與腦部海馬部位有關(guān)。
　　 本課

6、題從細胞水平,選取不同濃度的十溴聯(lián)苯醚作為目標化合物,體外傳代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞，用不同濃度的BDE-209 對新生鼠海馬神經(jīng)干細胞進行染毒，觀察神經(jīng)干細胞形態(tài),檢測NSCs的增殖分化及凋亡狀況，以此來研究BDE-209 對神經(jīng)干細胞的影響,探討神經(jīng)發(fā)育與環(huán)境因素的關(guān)聯(lián)，初步探討B(tài)DE-209 神經(jīng)毒性作用機制，本課題分為以下四個部分進行各項具體實驗。
　　 第一部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞的形態(tài)學(xué)的

7、影響
　　 目的：
　　 取新生1天SD大鼠的海馬組織進行無血清傳代培養(yǎng)，鑒別神經(jīng)干細胞的純度，染毒后測量形成神經(jīng)球數(shù)量及神經(jīng)球直徑，觀察BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞形態(tài)的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.購買新生1天SD大鼠，取大鼠海馬組織進行體外神經(jīng)干細胞培養(yǎng)。
　　 2.培養(yǎng)3-4代后海馬神經(jīng)干細胞進行神經(jīng)干細胞鑒定及純度鑒別。
　　 3.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠

8、海馬神經(jīng)干細胞吹打成單細胞懸液后，暴露于BDE-209，實驗共分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實驗B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　 4.染毒72h后，在倒置顯微鏡下進行神經(jīng)球形態(tài)觀察，利用美國Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目，

9、測量神經(jīng)球的平均直徑。
　　 結(jié)果：
　　 1.神經(jīng)干細胞鑒定結(jié)果：海馬組織培養(yǎng)經(jīng)3-5天可見神經(jīng)球形成,6-7后見神經(jīng)球逐漸增大，經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色證實新形成的神經(jīng)球呈現(xiàn)Nestin免疫染色陽性，提示所分離培養(yǎng)的細胞是神經(jīng)干細胞。
　　 2.海馬神經(jīng)干細胞培養(yǎng)3-4代后在倒置顯微鏡下觀察，由數(shù)十到數(shù)百個細胞聚集形成大小不等的神經(jīng)球，折光性強，周圍光暈明顯，吹打成單細胞懸液后行免疫細胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細胞的純度。

10、由結(jié)果可見分散的神經(jīng)干細胞是主體，可占90％以上。
　　 3．利用美國Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目，測量神經(jīng)球的平均直徑可見：實驗組可見神經(jīng)球數(shù)目明顯減少，且神經(jīng)球平均直徑明顯減小，隨著BDE-209濃度加大，神經(jīng)球數(shù)目減少，平均直徑減小。
　　 結(jié)論：
　　 所分離培養(yǎng)的細胞形成懸浮生長的神經(jīng)球，經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定是神經(jīng)干細胞。BDE-209可以導(dǎo)致新生鼠海馬細胞形成神經(jīng)球

11、數(shù)目及直徑改變，隨BDE-209濃度增加形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑有不同程度的下降。
　　 第二部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　 目的：檢測BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響.
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細胞暴露于BDE-209，實驗共分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實驗B組

12、：BDE-209濃度為30ug/ml，實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　 2.經(jīng)MTT細胞增殖檢測法，分別于24，48，72，96，120小時測定吸光度值3.繪制細胞生長曲線.對A值進行統(tǒng)計學(xué)分析.
　　 結(jié)果：
　　 MTT結(jié)果顯示細胞生長總趨勢上升,隨著BDE-209作用劑量的增加，增殖能力下降，經(jīng)相關(guān)分析可見海馬神經(jīng)干細胞增殖能力

13、與一定程度的BDE-209 暴露劑量成負相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 無血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經(jīng)干細胞具有自我更新和增殖能力，BDE-209 可以導(dǎo)致神經(jīng)干細胞增殖能力發(fā)生改變，隨BDE-209 濃度增加神經(jīng)干細胞增殖能力有不同程度的下降,這可能是BDE-209 神經(jīng)毒性的作用機制之一。
　　 第三部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞分化的研究
　　 目的：探討十溴聯(lián)苯醚對體外培

14、養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞分化的影響.
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細胞，在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并暴露于BDE-209，實驗共分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實驗B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。隔天半量換液。
　　 2

15、.7天后進行免疫熒光檢測，并運用美國Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)NF陽性,GFAP陽性,DAPI陽性細胞數(shù)目,計算NF+/DAPI+，GFAP+/DAPI+比例，并測量NF+細胞突起長度。
　　 結(jié)果：
　　 NF+細胞比例及NF+細胞突起長度隨著BDE-209濃度的增加而減少，GFAP+細胞比例隨著BDE-209濃度的增加而增加，存在劑量依賴關(guān)系.
　　 結(jié)論：
　　 BDE-20

16、9可以導(dǎo)致神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元的比例發(fā)生改變，隨BDE-209濃度增加神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元的比例有不同程度的下降，分化成神經(jīng)元的突起長度也有不同程度的下降。
　　 第四部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞凋亡的研究.
　　 目的：
　　 觀察BDE-209對海馬神經(jīng)干細胞凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細胞暴露于BDE-209，實驗共

17、分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實驗B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。24h后進行檢測。
　　 2.采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測神經(jīng)干細胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 不同濃度的BDE-209作用24 h 后，均可致神經(jīng)干細胞出現(xiàn)凋亡。實驗A,B,C組作用2