高壓氧預處理對大鼠視神經不完全損傷的保護效應及其機制研究.pdf

1、青光眼是全球最常見的不可逆性致盲眼病之一，青光眼視神經病變是該病致盲的根本原因。目前公認的發(fā)生機制是由于眼壓升高造成視網膜神經節(jié)細胞和其它視網膜細胞發(fā)生以變性壞死為特征的原發(fā)性損害，隨后又通過一系列途徑誘發(fā)以視網膜神經節(jié)細胞持續(xù)性凋亡為特征的繼發(fā)性損害，從而導致視神經功能進行性損傷。目前除了應用藥物、手術等手段降低升高的眼內壓，控制疾病的原發(fā)性損害以外，尚無有效手段防治視神經的繼發(fā)性損害。視神經由RGCs的軸索組成，是間腦白質的主要成分

2、，視神經和視網膜作為中樞神經系統(tǒng)在顱外的延伸，在位置上具有著中樞神經系統(tǒng)其他部分不可比似的易操作性，因而視神經損傷模型常被用來模擬大腦的軸突損傷；其中視神經鉗夾傷模型能夠較好地模擬RGCs繼發(fā)性凋亡，即使視神經被完全截斷后，仍有相當一部分數量的RGCs能夠存活一段時間。這種鉗夾傷后的神經退行性過程與青光眼視神經病變的病理過程相類似。
　　 高壓氧治療已在臨床應用多年，具有確切治療效果的疾病包括一氧化碳中毒、中風、空氣栓塞及減壓病

3、等。目前大量的研究顯示高壓氧預處理對大腦缺血缺氧引起的遲發(fā)型損傷有確切的神經保護作用，但HBO-PC保護效應的確切機制尚未闡明，在臨床應用前還需要大量的實驗證據。目前，人們普遍認為HBO誘導腦神經保護作用的機制主要有以下兩個方面：一是HBO預處理誘導機體組織細胞產生大量的活性氧，進而引起機體的抗氧化酶增多，增強機體抗氧化損傷能力；二是HBO預處理可誘導腦內的抗凋亡蛋白升高，增強機體的抗凋亡損傷能力。
　　 視神經鉗夾傷后的視網膜

4、神經元退行性變過程和腦損傷所引起的繼發(fā)性神經元退變過程相似，因此我們采用一種臨床實際工作中可行而有效的高壓氧預處理方法，從病理學、形態(tài)學、視功能等各個方面驗證這種預處理方法對視神經不完全損傷是否具有保護效應，并初步探討HBO預處理發(fā)揮視神經保護作用的分子機制。
　　 第一部分大鼠不完全視神經損傷模型的建立及高壓氧預處理對視神經不完全損傷的保護效應
　　 目的：建立穩(wěn)定的大鼠視神經鉗夾傷模型，研究高壓氧預處理對大鼠視神經不

5、完全損傷的保護效應。
　　 方法：采用2.5 ATA，100％O2，每天2次，連續(xù)2天的高壓氧預處理方法，末次處理后次日采用Yasargil動脈瘤夾制作大鼠視神經鉗夾傷模型。動物分為Sham組、ONC組，HBO+ONC組。分別在建模后1周或2周采用HE染色、熒光金逆行標記、閃光視覺誘發(fā)電位及TUNEL觀察或檢測視網膜神經節(jié)細胞的形態(tài)、數量和視神經功能的改變。
　　 結果：建模1周時Sham組視網膜節(jié)細胞層中HE著色的細胞

6、數量為89.5±9.4個/高倍視野，2周時為92.7±9.1個/高倍視野；而1周和2周時HBO+ONC組的視網膜節(jié)細胞層中HE著色的細胞數量顯著較ONC組多(69.3±7.4 vs56.6±6.5個/高倍視野，1 w，P＜0.01；62.3±6.1 vs46.1±6.6，2 w，P＜0.01)。建模2周時熒光金逆行標記顯示，Sham組的存活視網膜節(jié)細胞的平均密度為1650±216/mm2，而HBO+ONC組的視網膜神經節(jié)細胞平均密度顯著

7、高于Sham組(995±158/mm2和478±101/mm2，P＜0.01)。閃光視覺誘發(fā)電位結果顯示，相對于HBO+ONC組，ONC組P1波的潛伏期延長、振幅降低。視神經鉗夾傷后1周時Sham組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為90±4ms、944ms、108±6ms(P＜0.05，HBO+ONC vs ONC)；17±2μv、18±3μv和12±2μv(P＜0.01，HBO+ONC vs ONC)。2周時Sha

8、m組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為92±7ms、117±12ms、169±15ms(P＜0.01，HBO+ONC vs ONC)；21±3μv、14±2μv和7±1μv(P＜0.01，HBO+ONCvs ONC)。
　　 結論：HBO預處理能使視神經損傷后的視網膜節(jié)細胞存活率顯著提高，同時改善視神經的功能狀態(tài)，確認HBO預處理對大鼠視神經不完全損傷的保護效應。
　　 第二部分高壓氧預處理抑制線粒體

9、途徑的凋亡誘導對大鼠視神經不完全損傷的保護效應
　　 目的：研究高壓氧預處理對線粒體凋亡途徑的影響。
　　 方法：按第一部分方法進行高壓氧預處理和建模。使用TUNEL法檢測RGCs凋亡數量；ELISA法檢測視網膜caspase-3和caspase-9的酶活性；Western Blot檢測cytochrome c、Bcl-2、BclxL、和Bax蛋白表達量。
　　 結果：HBO預處理能明顯減少視神經不完全損傷后RG

10、Cs的凋亡陽性細胞數(ONC:19.1±4.2/HPF vs.HBO+ONC:7.2±1.3/HPF，P＜O.01)，ONC組視網膜組織的caspase-3和caspase-9酶相對活性顯著高于HBO+ONC組(P＞0.05)。HBO預處理顯著減少了視神經損傷后視網膜組織胞漿cytochrome c的蛋白水平(P＜0.05)，同時提高了抗凋亡蛋白Bcl-2、BclxL的水平(P＜0.01，P＜0.05)，但對促凋亡蛋白Bax的表達影響不

11、明顯(P＞0.05)。
　　 結論：高壓氧預處理可能通過抑制線粒體途徑的凋亡發(fā)揮對視神經不完全損傷的保護效應。
　　 第三部分高壓氧預處理調控HIF/EPO通路誘導對大鼠視神經不完全損傷的保護效應
　　 目的：研究HBO預處理的保護效應是否與氧化應激誘導大鼠視網膜中HIF-1及下游神經保護性基因EPO的表達有關。
　　 方法：按第一部分方法進行高壓氧預處理，末次處理后次日直接取材。動物分為對照組和HBO預

12、處理組。使用RT-PCR方法和Western Blot檢測HBO預處理對視網膜組織HIF-1及其下游基因EPO的mRNA表達和蛋白含量的影響，并檢測EPO下游信號分子P-Akt和HSP-27蛋白表達的影響。
　　 結果：HBO預處理能顯著上調大鼠視網膜組織中HIF-1和EPO mRNA的表達，分別是對照組的13.38±1.97倍和5.55±1.03倍(P＜0.01)；同時HIF-1α和EPO蛋白表達顯著增加，分別是對照組的1.8