新型高抗草甘膦EPSPS基因的克隆及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)鑒定.pdf

1、莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)(EC2.5.1.19)]是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草劑草甘膦是PEP的結(jié)構(gòu)類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合

2、成，最終導(dǎo)致植物死亡。有些微生物來源的EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，這一途徑是生物產(chǎn)生草甘膦抗性的被動(dòng)方式；另一方面，最新研究發(fā)?，F(xiàn)，草甘膦能被草甘膦 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)乙酰化，乙酰化的草甘膦失去與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，這是宿主生物獲得草甘膦耐受的主動(dòng)方式。 草甘膦的廣泛使用及其非選擇性的特點(diǎn)，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作

3、物成為研究熱點(diǎn)。但迄今為止，成功用于商業(yè)化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因只有CP4-EPSPS基因，許多本身無抗性或抗性不高的EPSPS基因，通過突變其氨基酸而降低與草甘膦之間親和性來產(chǎn)生草甘膦抗性的同時(shí)，也降低了與PEP之間的親和性，使酶活性不足，難以應(yīng)付反應(yīng)所需；另一方面，利用N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的草甘膦耐受機(jī)制培育的新抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物還未見問世。如今，改造草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，提高其抗性，培育新基因型抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物及結(jié)合高抗EPSPS

4、培育雙價(jià)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物成為新的研究方向。我國作為草甘膦生產(chǎn)和出口的大國，目前尚沒有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、適用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的EPSPS基因，在國際競爭中處于不利地位；而對草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的研究還處于起步階段。因此，尋找具自主知識產(chǎn)權(quán)的高抗草甘膦EPSPS新基因、開展對草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)的研究，對尋找抗草甘膦新基因中的專利保護(hù)位點(diǎn)以及改造、利用新基因培育新型抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物均具有積極意義。 本論文就當(dāng)前我國

5、抗除草劑作物基因工程中存在的“草甘膦抗性功能基因缺乏”這一主要問題，針對抗草甘膦的被動(dòng)和主動(dòng)機(jī)制，開展了對EPSPS和GAT的研究。充分利用我國極端污染環(huán)境微生物基因資源的生物多樣性，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了草甘膦極端污染土壤的宏基因組文庫，通過對大腸桿菌aroA突變株的功能互補(bǔ)對文庫進(jìn)行了篩選；并通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)，對部分活性位點(diǎn)作了分析鑒定，主要的研究成果如下： 1、構(gòu)建了大腸桿菌aro

6、A基因的插入突變株 對突變株進(jìn)行功能互補(bǔ)、通過突變株某一性狀的恢復(fù)來篩選基因是一種直接、巧妙、高效的方法，現(xiàn)已有諸多利用大腸桿菌突變株的功能互補(bǔ)來獲得目的克隆的報(bào)道。大腸桿菌的EPSPS由aroA基因編碼，當(dāng)aroA基因突變后，大腸桿菌的莽草酸途徑被阻斷，不能合成大腸桿菌生存所必需的芳香族氨基酸，使大腸桿菌喪失了在限制性培養(yǎng)基中生長的能力。但當(dāng)向該突變株中轉(zhuǎn)入EPSPS的編碼基因后，它能恢復(fù)在限制性培養(yǎng)基中的生長能力。因此，大腸

7、桿菌aroA基因突變株結(jié)合限制性培養(yǎng)篩選基是EPSPS基因的高效篩選平臺，構(gòu)建大腸桿菌aroA突變株是克隆草甘膦抗性EPSPS基因的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 傳統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌突變株的方法是依賴大腸桿菌自身Rec A和Rec BCD組成的Rec A重組系統(tǒng)，但此系統(tǒng)有較大的不足之處：Rec BCD具有核酸外切酶V活性，會(huì)降解線性DNA分子，所以必須構(gòu)建環(huán)形的具有靶位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒才能不被分解；另外，Rec A重組幾率很低，很難獲得所需的重組子

8、。 本研究首先構(gòu)建了中間帶有卡那霉素抗性篩選標(biāo)記、兩側(cè)片段與aroA基因同源的線性DNA片段AK(AK兩側(cè)與aroa的同源部分長度>500bp)及中間帶有氯霉素篩選標(biāo)記、兩側(cè)片段與aroA基因同源的線性DNA片段AC(兩側(cè)與aroA的同源臂為40bp)，將它們電擊轉(zhuǎn)化入含有輔助質(zhì)粒pKD46、能表達(dá)λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的大腸桿菌BW25113中。Red重組系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)直接利用線性DNA轉(zhuǎn)化來構(gòu)建大腸桿菌突變株，并且重組效率高。在

9、該系統(tǒng)的介導(dǎo)下，帶長同源臂的DNA片段AK與大腸桿菌基因組發(fā)生同源雙交換，獲得了卡那霉素抗性基因插入的aroA基因突變株AKM4188。AKM4188不能在限制性培養(yǎng)基中生長。但當(dāng)轉(zhuǎn)入自身EPSPS或HGT7 EPSPS的編碼基因后，它能恢復(fù)在限制性培養(yǎng)基中的生長能力。AKM4188的構(gòu)建，為新草甘膦抗性EPSPS基因篩選奠定了重要基礎(chǔ)。 2、建立草甘膦極端污染土壤的宏基因組文庫及高抗草甘膦EPSPS新基因的克隆 土壤微

10、生物中蘊(yùn)藏著巨大的基因資源，但利用現(xiàn)在的培養(yǎng)技術(shù)可培養(yǎng)的微生物只占其總量的1％以下，因此人們對這一資源寶庫的了解和利用還十分有限。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和微生物學(xué)研究手段的進(jìn)步，宏基因組(metagenomics)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。宏基因組技術(shù)能直接從環(huán)境樣品中提取總DNA，構(gòu)建總DNA文庫，通過功能分析或序列分析來篩選目的基因。這一技術(shù)為我們研究目前尚不可培養(yǎng)的微生物、開發(fā)新的基因資源提供了可能。據(jù)報(bào)道，通過功能篩選宏基因組的方法已經(jīng)獲

11、得了許多新的和已知抗生素的抗性基因，脂酶、幾丁質(zhì)酶、膜蛋白及代謝4-羥基丁酸的酶編碼基因，以及一些編碼生物素合成途徑的酶基因等。在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)應(yīng)用上潛力巨大。 本研究從草甘膦極端污染土壤中直接分離、提取細(xì)菌總DNA，經(jīng).9au3A I酶切成2至6kb的片段后，將其連入經(jīng)BamH I酶切、并去磷酸化的pACYC184質(zhì)粒。所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AKM4188后獲得約5，000個(gè)克隆的土壤宏基因組文庫。將這些克隆在含有草甘膦的限制性

12、培養(yǎng)基上篩選，從中分離得到能抗草甘膦近200mM的EPSPS新基因RD aroA。選擇部分Class Ⅰ型和Class Ⅱ型EPSP合酶氨基酸序列與本研究所獲得的RD EPSPS在http://www.ebi.ac.uk/selvices網(wǎng)上用T-Coffee進(jìn)行多基因序列比對表明RD EPSPS與Ⅰ型EPSPS氨基酸的identity值低于30％；而與Ⅱ型的EPSPS氨基酸的identity值高于50％，該結(jié)果說明RD EPSPS屬于

13、Ⅱ型EPSPS。比對結(jié)果還顯示RD EPSPS也具有與草甘膦抗性相關(guān)和維持PEP綁定相關(guān)的重要區(qū)域。將RD aroA在大腸桿菌中表達(dá)、對其表達(dá)產(chǎn)物的酶動(dòng)力學(xué)研究表明，RD EPSPS不僅具有高的草甘膦抗性(200mM)，Ki(glyphosate)為121μM，而且具有較高的PEP親和性[Km(PEP)：34μM]，提示該基因有望成為培育高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因材料。 3、草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)的鑒定 草甘膦被植

14、物吸收后會(huì)殘留在植物中，并在其分生組織中積累，植物的生長發(fā)育因此受到影響，從而降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量。草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)為解決這一問題提供了可能。草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能將草甘膦乙酰化生成乙酰草甘膦而使之解毒、失去除草劑活性。草甘膦乙酰化解毒可以避免草甘膦在植物體內(nèi)的積累，使得草甘膦在作物的整個(gè)生長周期都可應(yīng)用，不受生長發(fā)育階段的限制，同時(shí)也能耐受更高的草甘膦濃度。這一發(fā)現(xiàn)揭示了新的草甘膦耐受機(jī)制，為培育草甘膦耐受農(nóng)作物提供了另一可選

15、的模式。 雖然草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)已報(bào)道，但其抗性相關(guān)的保守區(qū)域及活性位點(diǎn)還尚不清楚。揭示該蛋白的活性位點(diǎn)，對在抗草甘膦新基因中尋找新的專利保護(hù)位點(diǎn)和高效特異的抑制劑以及改造、利用該基因均具有一定的指導(dǎo)意義。 本研究通過利用Rate4Site這一生物學(xué)軟件，根據(jù)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族進(jìn)化和拓?fù)鋵W(xué)的關(guān)系，預(yù)測了草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)。從保守區(qū)及非保守區(qū)各選取3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別檢測了突變體的草甘膦抗性，并

16、將各突變體在大腸桿菌中表達(dá)，突變體蛋白純化后進(jìn)行了圓二色譜(CD)及熒光光譜檢測。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在預(yù)測保守區(qū)的位點(diǎn)P<'134>(MTGAT1)、S<'52>(MTGAT13—2)、I<'53>(MTGAT87)發(fā)生突變后，GAT草甘膦的抗性幾乎喪失，并且其相應(yīng)的CD譜線和熒光譜線也較野生型發(fā)生了較大變化；而在非保守區(qū)的位點(diǎn)突變后，其草甘膦抗性及相應(yīng)的譜線并沒有發(fā)生變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物信息學(xué)軟件預(yù)測的結(jié)果基本一致。這一結(jié)果也提示