RasGRP3在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分RasGRP3在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及B細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)是以自身抗體的產(chǎn)生為特征的累及多個(gè)器官和組織的自身免疫病,內(nèi)源性的高反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞是狼瘡發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。SLE患者中存在免疫分子的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致BCR通路持續(xù)性激活,而RasGRP3(Rasguanylnucleotidereleasingprotein3,Ras鳥苷

2、酸釋放蛋白3)主要在B細(xì)胞中表達(dá),為BCR信號通路下游重要分子。本實(shí)驗(yàn)研究RasGRP3在SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中的表達(dá),并進(jìn)一步提取PBMC中的B細(xì)胞,研究RasGRP3在SLE患者外周血B細(xì)胞中的表達(dá),并探討其在SLE發(fā)病免疫機(jī)制的意義。
　　方法：收集臨床上確診SLE患者的外周血標(biāo)本20例,以及正常志愿者20例,Ficoll法提取SLE患者及正常人

3、外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分選法純化B細(xì)胞,流式檢測B細(xì)胞的純度。使用RT-PCR方法檢測SLE患者及正常人PBMC和B細(xì)胞中RasGRP3的mRNA表達(dá)及用WesternBlot方法檢測蛋白的表達(dá)。其中10例標(biāo)本用于PBMC中RasGRP3mRNA表達(dá)分析,5例標(biāo)本用于RasGRP3蛋白表達(dá)分析,5例標(biāo)本用于純化B細(xì)胞,檢測B細(xì)胞中RasGRP3mRNA的表達(dá)
　　結(jié)果：免疫磁珠分選法分選B細(xì)胞,其純度能達(dá)到90％以上。S

4、LE患者PBMC中RasGRP3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯高于正常人。在純化后的B細(xì)胞中,與正常人相比,SLE患者RasGRP3的mRNA表達(dá)水平也明顯升高。
　　結(jié)論：SLE患者外周血PBMC及B細(xì)胞中RasGRP3的mRNA和蛋白水平均較正常人高,提示B細(xì)胞中RasGRP3的異常表達(dá)可能參與狼瘡發(fā)病。
　　第二部分SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平與臨床資料的關(guān)聯(lián)
　　目的：研究RasGRP3的

5、mRNA表達(dá)與SLE患者臨床特征的聯(lián)系,探討其表達(dá)增高是否與SLE臨床體征,實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,病情活動程度有關(guān)。
　　方法：收集臨床上確診SLE患者26例用于分析PBMC中RasGRP3mRNA水平與臨床特征的關(guān)聯(lián),Ficoll法提取PBMC,RT-PCR方法半定量檢測其mRNA表達(dá)。通過回歸統(tǒng)計(jì)分析SLE患者疾病活動程度與其PBMC中RasGRP3的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。根據(jù)患者臨床特征以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果分組,使用T檢驗(yàn)研究Ras

6、GRP3的mRNA表達(dá)在每兩組間有無差異。
　　結(jié)果：SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA表達(dá)水平與SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)成正相關(guān)(p=0.0301),并且疾病活動期患者較靜止期患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平顯著增加(p<0.05)。血尿、蛋白尿的SLE患者與非血尿、蛋白尿的患者相比,RasGRP3的mRNA表達(dá)顯著增加(p<0.05)。
　　結(jié)論：RasGRP3可能為反應(yīng)狼瘡疾病活動的指標(biāo)之

7、一,并與腎臟損害有關(guān),但本次研究樣本量偏小,仍需大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　第三部分地塞米松對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中RasGRP3表達(dá)的影響
　　目的：分別體內(nèi)外研究糖皮質(zhì)激素對SLE患者PBMC中RasGRP3的作用,探討糖皮質(zhì)激素通過抑制RasGRP3的表達(dá)治療SLE的機(jī)制。
　　方法：選取臨床上使用糖皮質(zhì)激素(約1mg/kg強(qiáng)的松)的SLE患者10例,抽取其糖皮質(zhì)激素治療前及治療后兩周的外周血,提取PBMC。其中5

8、例檢測治療前后PBMC中RasGRP3的mRNA表達(dá)水平,5例檢測蛋白表達(dá)水平。在體外實(shí)驗(yàn)中,使用兩種不同濃度地塞米松(1×10-5、1×10-6mol/L),與正常人PBMC細(xì)胞共同培養(yǎng),在孵育時(shí)間為0h,12h,24h提取細(xì)胞,使用RT-PCR的方法檢測RasGRP3的mRNA水平,選取合適的濃度。另外收集未經(jīng)治療的SLE患者6例,使用該濃度的地塞米松共孵育,觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h)的地塞米松對PBMC中RasGRP3

9、的mRNA水平的影響。并在地塞米松孵育0h,24h,48h提取細(xì)胞,使用westernblot方法檢測RasGRP3蛋白水平及下游信號通路p-ERK,p-AKT的水平。
　　結(jié)果：未使用糖皮質(zhì)激素治療時(shí),SLE患者PBMC中RasGRP3的表達(dá)高于正常人,使用中等劑量糖皮質(zhì)激素治療2周后,RasGRP3的表達(dá)明顯下降,接近正常人的表達(dá)水平。地塞米松能抑制正常人PBMC中RasGRP3的mRNA表達(dá),1×10-6mol/L濃度的地塞

10、米松對RasGRP3表達(dá)的有抑制作用且未明顯引起細(xì)胞凋亡。使用該濃度的地塞米松與SLE患者PBMC共培養(yǎng),觀察不同時(shí)間點(diǎn)地塞米松對RasGRP3的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn),24h時(shí)地塞米松對PBMC內(nèi)RasGRP3的mRNA及蛋白水平抑制作用最強(qiáng)。同時(shí)在24h地塞米松能明顯抑制PBMC中pERK及p-AKT的表達(dá)。
　　結(jié)論：SLE患者在臨床治療時(shí),使用糖皮質(zhì)激素治療2周后,PBMC中RasGRP3的水平下降。地塞米松能抑制正常人及SL