楊樹(shù)CCR基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、木質(zhì)素是地球上數(shù)量?jī)H次于纖維素的有機(jī)物,林木中木質(zhì)素占木材干重的15％～36％,木質(zhì)素生物合成及調(diào)節(jié)在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮重要作用,另一方面,木質(zhì)素是制漿造紙業(yè)的不利因素,脫除纖維素中的木質(zhì)素,需要消耗大量能源和使用有毒化學(xué)物質(zhì),提高了造紙成本并污染環(huán)境。近十幾年來(lái),隨著人們對(duì)木質(zhì)素生物合成研究的深入,木質(zhì)素生物合成途徑許多酶的編碼基因被不斷分離克隆出來(lái),調(diào)控木質(zhì)素生物合成途徑中重要酶基因的表達(dá),通過(guò)抑制酶的活性,從而阻斷木質(zhì)素生物合成

2、途徑,降低木質(zhì)素的合成量或單體組成,已經(jīng)在煙草和楊樹(shù)等植株上取得了成功。因此,利用生物技術(shù)手段降低木質(zhì)素含量或改變其組成,提高楊樹(shù)的制漿性能,創(chuàng)造出符合造紙?jiān)弦蟮牧帜酒贩N,對(duì)于降低制漿造紙的經(jīng)濟(jì)成本和保護(hù)環(huán)境等都具有重要意義。CCR是木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一,在木質(zhì)素生物合成途徑中處于終端位置。RNAi是一種重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遺傳改良研究中廣泛應(yīng)用。為優(yōu)化和建立楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系,探討RNAi技術(shù)在楊樹(shù)木質(zhì)素改

3、良中的應(yīng)用效果,建立楊樹(shù)RNAi的分子育種新方法,本文以南林95葉片為外植體,對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行較系統(tǒng)地研究,構(gòu)建了肉桂酰輔酶A還原酶基因CCR干涉表達(dá)載體pBI121+2F,開(kāi)展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了篩選、PCR檢測(cè)和木質(zhì)素含量檢測(cè),獲得了如下主要結(jié)果： 1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因組DNA,利用PCR技術(shù)克隆得到CCR基因的第4個(gè)外顯子部分序列,并將其正向和反向克隆到pUCC

4、RNAi載體上,通過(guò)酶切、純化、連接、轉(zhuǎn)化等一系列基因工程操作方法構(gòu)建了含CaMV35S組成型啟動(dòng)子和卡那霉素篩選基因的RNAi表達(dá)載體pBI121+2F,并將其成功的導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。 2、以南林95為試材,對(duì)其葉片再生體系進(jìn)行了優(yōu)化,建立了高效的葉盤(pán)法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了經(jīng)抗Kan篩選的RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。 3、對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR,檢測(cè),獲得了RNAi片段的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)培養(yǎng)3個(gè)月的