豬FcRn介導(dǎo)IgG轉(zhuǎn)運(yùn)及TGEV感染激活NF-κB信號通路調(diào)控FcRn表達(dá)的研究.pdf

1、大約95％以上病原微生物都是通過黏膜途徑入侵機(jī)體的，因此黏膜免疫日益受到人們的重視。一般認(rèn)為黏膜免疫主要是通過多聚免疫球蛋白受體(pIgR)介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG，并在黏膜表面保護(hù)機(jī)體防止病原入侵的過程中起到重要作用。而IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面主要是通過新生兒Fc受體(FcRn)介導(dǎo)的。目前大量的研究主要集中在對人和小鼠的FcRn功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究，但是對于豬源的FcRn功能的研

2、究比較少，同時(shí)國內(nèi)外尚未見到有關(guān)病原感染對FcRn表達(dá)調(diào)控方面的研究。因此，本研究擬應(yīng)用豬小腸上皮細(xì)胞系（IPEC-J2）構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型，研究豬FcRn介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運(yùn)功能;同時(shí)研究豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染IPEC-J2細(xì)胞激活NF-κB信號通路對FcRn的表達(dá)調(diào)控。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.豬小腸上皮細(xì)胞FcRn的表達(dá)及分布
　　根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的豬FcRnα鏈基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以IPEC-J2細(xì)胞的

3、總RNA為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了FcRnα鏈基因片段。經(jīng)Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)FcRn蛋白在IPEC-J2細(xì)胞系上的表達(dá)。進(jìn)一步通過間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)FcRn主要分布在極化的IPEC-J2細(xì)胞的頂膜側(cè);仔豬空腸組織切片檢測結(jié)果也顯示FcRn主要分布在小腸絨毛上皮細(xì)胞的頂膜側(cè)。
　　2.豬FcRn介導(dǎo)IgG雙向胞轉(zhuǎn)作用的研究
　　以IPEC-J2細(xì)胞構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型，將生物素標(biāo)記的豬IgG(biotin

4、-IgG)加入到胞轉(zhuǎn)模型，進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)極化的IPEC-J2細(xì)胞在37℃可以雙向轉(zhuǎn)運(yùn)IgG，在4℃不能轉(zhuǎn)運(yùn)IgG。以上結(jié)果證明IgG是跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)穿過上皮細(xì)胞屏障。為了進(jìn)一步研究IgG跨極化上皮細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)是由FcRn特異性介導(dǎo)的，在biotin-IgG胞轉(zhuǎn)過程中加入protein A或未標(biāo)記的IgG作為抑制劑。結(jié)果顯示在加入protein A或未標(biāo)記的IgG后，明顯抑制了IgG雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)

5、果也證明了FcRn可以與IgG在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合并介導(dǎo)IgG跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。運(yùn)用免疫共沉淀的方法證明了FcRn與IgG結(jié)合是pH依賴的，即在酸性條件下pH＜6.5，F(xiàn)cRn與IgG結(jié)合，在中性偏堿性條件下pH＞7.0，F(xiàn)cRn與IgG不結(jié)合。由于FcRn可以介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，在胞轉(zhuǎn)模型中，以TGEV為模式病原，將抗TGEV特異性IgG加入到細(xì)胞底側(cè)小室，在極化的IPEC-J2細(xì)胞頂側(cè)小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FcR

6、n轉(zhuǎn)運(yùn)特異性IgG能夠中和病毒。以上結(jié)果說明FcRn介導(dǎo)IgG轉(zhuǎn)運(yùn)穿過黏膜屏障，在保護(hù)機(jī)體防止病原通過黏膜表面入侵的過程中起到重要作用。
　　3.TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞激活NF-κB信號通路對FcRn表達(dá)調(diào)控的研究
　　NF-κB是一個(gè)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要涉及與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞能夠激活NF-κB信號通路。首先，運(yùn)用NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測T

7、GEV感染IPEC-J2細(xì)胞對NF-κB的激活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能顯著增強(qiáng)NF-κB熒光素酶活性。進(jìn)一步通過pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞，在TGEV感染后，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示p65轉(zhuǎn)位入核。TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞，通過熒光定量PCR和Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)能顯著上調(diào)FcRn的表達(dá)。經(jīng)在線軟件分析FcRn啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)除了具有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)還有MAPK下游的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

8、，因此為了確定NF-κB和MAPK在FcRn上調(diào)表達(dá)中的作用，應(yīng)用NF-κB抑制劑和MAPK相關(guān)抑制劑處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑處理的細(xì)胞能顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達(dá)，而MAPK抑制劑處理的細(xì)胞不影響TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達(dá)。說明FcRn的上調(diào)表達(dá)與NF-κB信號通路密切相關(guān)。進(jìn)一步根據(jù)在線軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)將FcRn啟動(dòng)子區(qū)域不斷截短，最終構(gòu)建了9個(gè)不同長度的FcRn啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，經(jīng)熒光素酶活性檢測發(fā)