電針足三里對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用.pdf

1、心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusionI/R）損傷是一種多因素參與的復(fù)雜病理過程，涉及到多個(gè)環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，心肌I/R損傷是炎癥反應(yīng)過度表達(dá)，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)共同參與的結(jié)果，由白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞為主）和細(xì)胞因子、趨化因子激活為主的炎癥反應(yīng)在心肌缺血階段即被激活，再灌注則顯著加劇心肌的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此防治心肌I/R損傷的有效辦法除了盡快恢復(fù)心肌血流的再灌注外，如何拮抗炎癥的過度表達(dá)在心肌中的損傷作用，適時(shí)保護(hù)

2、心肌是我們目前研究的主要方向。研究表明，刺激外周迷走神經(jīng)及應(yīng)用膽堿能遞質(zhì)乙酰膽堿或擬膽堿藥物煙堿能抑制內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，顯著降低細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的釋放，同時(shí)不影響抑炎因子IL-10的釋放，并將之命名為“膽堿能抗炎通路”（thecholinergicanti-inflammatorypathway，CAP）。心肌缺血再灌注損傷與內(nèi)毒素血癥、低血容量失血性休克均有相同病理機(jī)制，即由許多

3、炎癥介質(zhì)參與、機(jī)體失控性過度的炎癥反應(yīng)的病理過程，同時(shí)基于傳出迷走神經(jīng)電刺激對(duì)上述動(dòng)物模型均具有抗過度炎癥以及器官保護(hù)的研究結(jié)果，我們假設(shè)采取任何措施興奮迷走神經(jīng)傳出纖維，都有可能激活該通路達(dá)到治療心肌I/R損傷?，F(xiàn)有資料表明，針刺足三里能夠興奮迷走神經(jīng)中樞，并增加其傳出纖維的電活動(dòng)，而有關(guān)電針足三里對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌的影響和機(jī)制研究目前尚未有人報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過電針足三里，研究該方法對(duì)I/R損傷心肌是否也具有保護(hù)作用。

4、 目的：通過運(yùn)用電針足三里刺激或迷走神經(jīng)電刺激研究興奮膽堿能抗炎通路對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用，探討其作用機(jī)制。 方法：雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為5組：①手術(shù)對(duì)照組（SHAM組）②心肌缺血再灌注組（IR組）③迷走神經(jīng)刺激組（STM組）④電針足三里組（ZSL組）⑤非經(jīng)非穴組（FJFX組），除SHAM組外，各組均行心肌缺血30min再灌注，STM組于再灌前后各10min，共20min，以5V、2ms、1HZ強(qiáng)度持續(xù)刺激

5、左頸迷走神經(jīng)，ZSL組于再灌前后各15min，共30min，行電針足三里刺激，F(xiàn)JFX組于再灌前后各15min，共30min，行電針非經(jīng)非穴刺激。記錄心律失常發(fā)生率，心率（heartrate，HR），平均動(dòng)脈壓（meanarterialpressure，MAP）變化；再灌注120min后，處死動(dòng)物，采集標(biāo)本。常規(guī)方法石蠟切片行蘇木素一伊紅（HematoxylinandEosinStaining，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌的炎癥改變

6、；伊文思藍(lán)/氯化三苯基四唑（Evan'sBlue/2，3，5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchloride，EB/TTC）測(cè)定心肌梗死面積與免疫比濁法測(cè)定血漿肌鈣蛋白Ⅰ濃度；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）檢測(cè)心肌和血漿中腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）含量和白介素-6（interleukin-6，IL-6）含量；分光光度法測(cè)

7、定心肌組織髓過氧化物酶（MyeloperoxidasMPO）活性；硫代巴比妥酸法測(cè)定心肌組織丙二醛（MalondialdehydeMDA）含量；免疫組化分析心肌核轉(zhuǎn)錄因子p65（nulearfactor-kappaBp65NF-κBp65）表達(dá)；原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：1.血流動(dòng)力學(xué)和心律失常觀察：除SHAM組外，再灌120min后各組心率，平均動(dòng)脈壓較缺血前均有下降（p<0.05），各組之間MAP

8、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。STM組、ZSL組心率在刺激階段有下降，STM組下降較ZSL組更明顯，但波動(dòng)幅度仍在10％以內(nèi)，刺激停止后，心率回升。STM組、ZSL組再灌后心律失常發(fā)生率明顯低于IR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）； 2、組織形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下發(fā)現(xiàn)SHAM組心肌結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列緊密、界限清楚，無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤；IR組、FJFX組心肌排列稀疏，不規(guī)則，細(xì)胞水腫，部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡變性、心肌纖維斷

9、裂，細(xì)胞間隙明顯增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤；STM組、ZSL組心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞間隙增寬，炎性細(xì)胞散在浸潤； 3、心肌損傷程度觀察：各組心肌行EB/TTC染色顯示，各組間缺血范圍差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與IR組相比，STM組和ZSL組心肌梗死范圍差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），心肌梗死范圍減小，而ZSL組和STM組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），F(xiàn)JFX組和IR組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）

10、，各組心肌肌鈣蛋白（cTnI）在心肌缺血前無明顯差別，再灌注120min后，除SHAM組外，其他各組cTnI較缺血前均有不同程度的升高（P<0.05），STM組和ZSL組cTnI濃度低于IR組（P<0.05），STM組和ZSL組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）； 4、炎性標(biāo)志物和氧化損害程度觀察：與SHAM組相比，各組MPO活性和MDA含量顯著增高，以IR組升高更為顯著（P<0.01），與ZSL組和STM組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義（P<0.05），心肌組織和血漿中的TNF及IL-6的濃度在IR組、STM組、ZSL組、FJFX組明顯升高，與SHAM組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中IR組升高更為顯著，與ZSL組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；STM組與ZSL組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫組化檢測(cè)NF-κBp65表達(dá)，IR組大部分心肌細(xì)胞中，細(xì)胞漿染色呈陽性，細(xì)胞核染色呈陽性，ZSL組和STM組心肌細(xì)胞的胞漿呈弱陽性或陽性，細(xì)

12、胞核染色呈弱陽性，核移位細(xì)胞數(shù)目減少。平均光密度值比較發(fā)現(xiàn)STM組、ZSL組NF-κBp65表達(dá)低于IR組（P<0.05）； 5、細(xì)胞凋亡觀察：TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，在SHAM組中，未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞，相反，在IR組中，呈現(xiàn)大量TUNEL陽性細(xì)胞核呈棕黃色反應(yīng)，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，形成密集顆粒位于核膜下，有的胞核被降解，胞漿不著色。ZSL組、STM組可見散在的陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)（apoptosisindexAI）比較發(fā)