蛋用鵪鶉產(chǎn)蛋相關(guān)基因克隆、表達(dá)及其與性狀的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、產(chǎn)蛋性狀一直是家禽生產(chǎn)中非常重要的性狀之一，對(duì)于家禽養(yǎng)殖效益具有決定意義。蛋用鵪鶉是家禽生產(chǎn)中的重要特禽，具有適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、性成熟早、產(chǎn)蛋多、耗料少、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是近年來家禽產(chǎn)業(yè)中發(fā)展較快的一支，被譽(yù)為繼養(yǎng)雞之后的“第二家禽業(yè)”。目前已經(jīng)通過傳統(tǒng)的育種方法相繼培育出多個(gè)可供生產(chǎn)應(yīng)用的蛋用鵪鶉品種（配套系），并開展了一些鵪鶉分子生物學(xué)方面的研究工作。然而，相對(duì)于雞和其它畜禽，針對(duì)鵪鶉的相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記的開發(fā)較少，研究

2、明顯滯后，極大限制了分子生物技術(shù)在蛋用鵪鶉育種中的應(yīng)用。利用候選基因法并借鑒在豬、雞等畜禽上已獲得的成果、經(jīng)驗(yàn)開展蛋用鵪鶉產(chǎn)蛋相關(guān)基因的研究，將對(duì)于深入了解鵪鶉產(chǎn)蛋性狀的形成機(jī)理、開發(fā)可利用的分子生物學(xué)標(biāo)記，最終推進(jìn)我國(guó)蛋用鵪鶉分子育種進(jìn)程具有積極的意義。
　　本研究以我國(guó)自主培育的鵪鶉配套系—神丹Ⅰ號(hào)鵪鶉的H系、L系及野外捕捉的野生鵪鶉群體作為研究對(duì)象，選擇與鵪鶉產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的ESR1、GnRH1、PRLR、VIPR-1基因作為

3、侯選基因，開展鵪鶉產(chǎn)蛋相關(guān)候選基因的克隆、表達(dá)、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)及性狀關(guān)聯(lián)性分析研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)鵪鶉ESR1基因的外顯子1、外顯子4和外顯子8進(jìn)行SNP篩查，共檢測(cè)到5個(gè)新SNPs位點(diǎn)，其中C312T位點(diǎn)、C50T位點(diǎn)和C91T位點(diǎn)分別導(dǎo)致了限制性內(nèi)切酶PvuⅡ、Hpy18I和AccⅠ酶切位點(diǎn)的改變。
　　采用PCR-RFLP方法分析了三個(gè)突變位點(diǎn)在不同鵪鶉群體中的基因型分布，結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn):不同突變位點(diǎn)在不同鵪鶉群體間的基因型頻率和等位基因頻率分布均存在顯著差異，無論是C312T、C50T或C91T位點(diǎn)，在H群體中，C等位基因均為其優(yōu)勢(shì)基因，而在野生鵪鶉群體中，等位基因T一直為優(yōu)勢(shì)基因;基因型、單倍型與鵪鶉繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明:外顯子1的C312T位點(diǎn)對(duì)鵪鶉開產(chǎn)日齡具有顯著影響;外顯子4上C50T突變位點(diǎn)與鵪鶉開產(chǎn)日齡和20周產(chǎn)蛋量存在相關(guān)性。外顯子8上C91T位點(diǎn)與鵪鶉的開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋數(shù)、20周蛋重之間存在

5、相關(guān)，且差異顯著。單倍型分析結(jié)果表明，不同的單倍型個(gè)體H1H1(CTCT)或H1H3(CTTT)與鵪鶉20周蛋重、20周齡產(chǎn)蛋數(shù)之間存在相關(guān)性，且差異顯著。
　　2.利用比較基因組學(xué)方法克隆出鵪鶉GnRH1基因部分cDNA序列359bp，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:該基因存在一個(gè)跨模結(jié)構(gòu)域和一個(gè)信號(hào)肽（第1至第21氨基酸）區(qū)域;半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，鵪鶉GnRH1基因在所檢測(cè)的組織中存在表達(dá)差異。該基因在心臟、肺、腿肌、

6、胸肌、胰臟中不表達(dá)，而在腸、肝臟、卵巢、脾臟、腎臟和下丘腦中有表達(dá)，其中以脾臟的表達(dá)量最高，下丘腦次之，肝臟的表達(dá)量最低。
　　在鵪鶉GnRH1基因的外顯子2-3區(qū)域共檢測(cè)到6個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中C108T位于第2外顯子區(qū)域，其突變?yōu)橥x突變，其它5個(gè)突變位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域。
　　3.采用比較基因組及RACE方法克隆獲得了鵪鶉PRLR基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，該序列總長(zhǎng)3106bp，包括CDS區(qū)、5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū);生物信

7、息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該基因具有一個(gè)跨模結(jié)構(gòu)域和5處包含N末端糖基化位點(diǎn)(N-X-S或N-X-T);半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，鵪鶉PRLR基因在所有檢測(cè)組織中廣泛表達(dá)，其中表達(dá)量最高的為腸、其次為下丘腦、心臟，胸肌、腿肌，卵巢中的表達(dá)量最低。在鵪鶉PRLR基因的內(nèi)含子1區(qū)域檢測(cè)到6個(gè)SNP位點(diǎn)，其中C104T突變位點(diǎn)能夠被Hpy188I酶切，性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明:該突變位點(diǎn)形成的三種基因型分別與鵪鶉的開產(chǎn)日齡和20周產(chǎn)蛋數(shù)存在相關(guān)性，

8、且存在明顯差異。
　　4.通過PCR-RFLP的方法，結(jié)合基因池策略，開展了VIPR-1基因外顯子4-7區(qū)域，序列長(zhǎng)度2021bp范圍內(nèi)基因的多態(tài)性掃描，從研究中共檢測(cè)到突變位點(diǎn)36個(gè)，其中有3個(gè)突變位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域，其它突變均位于內(nèi)含子區(qū)域。選擇兩個(gè)位點(diǎn)G373T和A313G進(jìn)行酶切分型，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)在三個(gè)鵪鶉群體中的等位基因頻率存在差異。在G373T位點(diǎn)，等位基因T為H群體的優(yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率為0.5417;而在A313