過表達血管緊張素轉化酶2基因預防低氧性肺動脈高壓的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 低氧性肺動脈高壓是呼吸系統(tǒng)的常見病，目前缺乏理想的治療手段，患者預后差。低氧性肺血管收縮和肺血管重塑是低氧性肺動脈高壓發(fā)病機制中的兩個主要環(huán)節(jié)。肺血管重塑在低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機制中起了十分重要的作用，是目前研究的熱點，主要表現(xiàn)為肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和遷移所致的肺小動脈壁中層增厚及遠端無肌細動脈的肌化。低氧通過上調血管緊張素轉化酶(ACE)的表達，發(fā)揮誘導肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和遷移的作用，從而促

2、進肺血管重塑的發(fā)生。血管緊張素轉化酶2(ACE2)是新發(fā)現(xiàn)的一個ACE的同工酶。ACE和ACE2是存在于RAS系統(tǒng)中的相互對立的一對核心樞紐，他們共同調控許多疾病。ACE2通過促進Ang-(1-7)的產生，降解AngⅡ，而發(fā)揮拮抗ACE的作用，局部組織的ACE和ACE2比例失衡可導致多種疾病。且在這些疾病當中往往存在ACE的表達上調，而ACE2的表達相對不足，若通過各種方式上調ACE2的表達可逆轉疾病的發(fā)展。研究顯示長時間的低氧可導致A

3、CE和ACE2之間的比例失衡，且ACE2能抑制低氧所誘導的肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和遷移作用，表現(xiàn)出與ACE相拮抗的作用，這提示ACE2可能具有抑制血管重塑發(fā)生的作用。
　　 基于以上分析，我們推測局部表達ACE2能有效的抑制肺血管重塑，具有治療低氧性肺動脈高壓的潛力。本研究以慢病毒為載體，局部表達ACE2，觀察其抑制肺血管重塑及緩解肺動脈高壓的作用，以期為低氧性肺動脈高壓的臨床治療提供理論基礎和實驗依據。
　　 方法

4、：
　　 將大鼠原代肺動脈平滑肌細胞經不同時間段低氧干預(0h，6h，12h，24h，48h)，用RT-PCR及Westernblot方法觀察PASMCs的ACE、ACE2在mRNA和蛋白水平的表達及兩者的比例有否失衡；建立低氧性肺動脈高壓模型，比較常氧對照組和低氧干預組大鼠肺組織的ACE、ACE2在mRNA和蛋白水平的表達及兩者的比例有否失衡。構建過表達ACE2基因的慢病毒載體，轉染大鼠原代肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)，分

5、別用CCK-8法、Transwell小室法比較ACE2轉染組與對照病毒轉染組PASMCs的增殖、遷移能力；將過表達ACE2基因的慢病毒液經氣道內滴注的方式感染SD大鼠，同時設立對照病毒感染組及常氧對照組。2周后將大鼠分別常氧、低氧下飼養(yǎng)，4周后通過檢測各組右心室收縮壓(RVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)、顯微鏡下肺血管重塑指標，觀察其抑制肺血管重塑及緩解肺動脈高壓的作用。
　　 結果：
　　 (1)大鼠原代PASMC

6、s的ACEmRNA和蛋白表達量隨低氧培養(yǎng)時間增加而逐漸升高，一直持續(xù)至48h(P<0.01)；ACE2mRNA和蛋白表達量分別在低氧培養(yǎng)12h、24h時達到高峰(P<0.05)，隨后下降。ACE和ACE2mRNA、蛋白表達的比值在低氧培養(yǎng)48h前各時間段無顯著差異，而48h時出現(xiàn)兩者比例明顯升高(P<0.05)。
　　 (2)低氧組與常氧組相比，其肺組織ACEmRNA表達升高，有顯著差異(P<0.01)；ACE2mRNA兩組間無

7、顯著差異；ACEmRNA與ACE2mRNA比值升高(P<0.05)。ACE的蛋白表達兩組間無統(tǒng)計學差異；ACE2的蛋白表達，低氧干預組明顯低于常氧對照組(P<0.05)；ACE/ACE2的比值低氧干預組明顯高于常氧對照組(P<0.05)。
　　 (3)CCK-8細胞增殖實驗顯示無論常氧和低氧條件下，轉染ACE2基因的PASMCs細胞增殖能力較對照病毒轉染組明顯下降(P<0.05)；Transwell遷移實驗顯示細胞遷移能力較對照

8、組顯著下降(P<0.01)。
　　 (4)低氧+ACE2轉染組大鼠的RVSP較低氧+對照病毒轉染組明顯降低[(36.45±0.64)mmHgVS(41.21±1.26)mmHg，P<0.05]，RVHI亦明顯降低(0.24±0.01VS0.32±0.03，P<0.05)；低氧+ACE2轉染組與低氧+對照病毒組相比血管重塑指標WT％明顯降低[(25.68±2.07)％VS(41.58±2.81)％，P<0.01]；WA％亦明顯降低

9、[(32.22±3.24)％VS(44.08±4.96)％，P<0.05]。
　　 結論：
　　 本研究結果表明：(1)低氧可誘導大鼠原代肺動脈平滑肌細胞的ACE/ACE2表達的失衡，而低氧性肺動脈高壓大鼠模型肺組織中ACE/ACE2表達亦失衡，提示ACE2與低氧性肺血管重塑和肺動脈高壓的形成有關。(2)轉染過表達ACE2基因后離體PASMCs的增殖和遷移能力明顯抑制。以慢病毒為載體，通過氣道內滴注的轉染途徑將過表達AC