利用CRISPR-Cas9和Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗.pdf

1、偽狂犬病毒是α-皰疹病毒屬成員，基因組由150kb左右的DNA雙鏈構(gòu)成。偽狂犬病毒感染豬只后會誘發(fā)宿主嚴(yán)重的傳染性疾病，給全世界生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。雖然長期以來偽狂犬病毒疫苗得到了廣泛應(yīng)用并很好地控制了該病的流行，但近年來偽狂犬病突然在我國經(jīng)過疫苗免疫的豬場爆發(fā)并在全國范圍內(nèi)流行，成為目前我國生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨的最大危害之一，這表明傳統(tǒng)疫苗失去了對偽狂犬病的免疫保護(hù)作用，更多研究報道也進(jìn)一步說明該病毒的基因組或主要抗原基因已經(jīng)發(fā)

2、生變異。傳統(tǒng)制備偽狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多個毒力基因，并經(jīng)過共幾十輪的低熔點(diǎn)瓊脂糖空斑純化，耗時耗力。因此亟需更高效經(jīng)濟(jì)的病毒疫苗制備策略來應(yīng)對變異毒株的爆發(fā)和流行等問題。
　　本課題構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9和Cre/lox基因編輯系統(tǒng)的快速制備偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗的新方法，同步敲除偽狂犬病毒變異毒株P(guān)RV-HNX的TK和gE兩個毒力基因，成功制備了偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗侯選株，對當(dāng)下流行的偽

3、狂犬病有較好的免疫保護(hù)作用。主要步驟概括如下:
　　一，利用CRISPR/Cas9和同源重組修復(fù)機(jī)制同時將綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(mCherry)分別重組到PRV-HNX基因組gE和TK基因位點(diǎn)。
　　二，利用單細(xì)胞流式分選和低熔點(diǎn)瓊脂糖挑斑純化得到PRV-ΔgE-ΔTK-GFP-mCherry重組毒。提取重組毒基因組DNA，PCR鑒定重組病毒是否純化。
　　三，再利用Cre/lox重組系統(tǒng)將重組病毒基因