基于密碼子優(yōu)化的VP1基因表達(dá)蛋白檢測1型和3型鴨甲肝病毒抗體的膠體金試紙條.pdf

1、鴨甲肝病毒（Duck hepatitisAvirus，DHAV）引起的鴨病毒性肝炎主要侵害3周齡以下雛鴨，死亡率高達(dá)90％以上。VP1蛋白位于DHAV衣殼表面，是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是病毒粒子抗原性的主要組成部分。已有研究資料表明，1型和3型鴨甲肝病毒（DHAV-1和DHAV-3）存在抗原交叉，為建立簡單快速的檢測DHAV-1和DHAV-3抗體的方法，本研究對DHAV-1 X株的結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后克隆到pET-28a

2、(+)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/optiVP1并進(jìn)行原核表達(dá)，純化表達(dá)蛋白，開展了基于密碼子優(yōu)化型VP1重組蛋白的檢測DHAV-1和DHAV-3抗體的膠體金免疫層析試紙條的研制等一系列研究，主要結(jié)果如下:
　　1.DHAV-1 VP1基因稀有密碼子及抗原表位分析
　　通過生物信息學(xué)在線網(wǎng)站分析1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)X株VP1基因稀有密碼子情況和抗原表位，發(fā)現(xiàn)VP1中含26個(gè)稀有密碼子，稀有密碼子含

3、量較多，且存在五處連續(xù)稀有密碼子，1-72位氨基酸序列和83-238位氨基酸序列抗原表位較豐富。并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性對VP1密碼子進(jìn)行改造，人工合成密碼子優(yōu)化型VP1(optiVP1)基因。
　　2.VP1和optiVP1基因克隆表達(dá)、鑒定及純化
　　通過RT-PCR擴(kuò)增了預(yù)期大小的DHAV-1-X VP1全基因序列，將目的片段VP1和optiVP1分別克隆至pET-28a(+)上，構(gòu)建兩種原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(

4、+)/VP1和pET-28a(+)/optiVP1并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果表明，只有optiVP1成功表達(dá)，在0.4 mmol/LIPTG、37℃誘導(dǎo)12h的表達(dá)量最大，表達(dá)的重組蛋白大小約為32 kDa，以包涵體的形式存在。采用切膠回收方法獲得純度較高的重組蛋白，Western blot分析結(jié)果表明該蛋白可被兔抗DHAV-1抗體和兔抗DHAV-3抗體識別，具有良好的反應(yīng)原性。
　　3.optiVP1多

5、克隆抗體的制備
　　用純化的optiVP1蛋白免疫昆明鼠，制備的鼠抗optiVP1高免血清的間接ELISA效價(jià)達(dá)到1∶51200，間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)該鼠抗optiVP1血清能識別DHAV-1和DHAV-3，表明optiVP1具有良好的免疫原性。
　　4.檢測DHAV抗體的金標(biāo)試紙條的研制及應(yīng)用
　　以optiVP1蛋白為抗原制備了雙抗原夾心法(ICS-sM)和間接法(ICS-ID)檢測DHAV抗體的膠體金免疫層析試紙

6、條，特異性試驗(yàn)結(jié)果表明制備的金標(biāo)試紙條能夠檢測DHAV-1抗體和DHAV-3抗體，對鴨疫里默氏菌（RA）、鴨瘟、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌等鴨常見病的陽性血清檢測結(jié)果為陰性，特異性好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)DHAV-1陽性血清作1∶64稀釋時(shí)，檢測結(jié)果仍呈陽性;當(dāng)DHAV-3陽性血清作1∶32稀釋時(shí)，檢測結(jié)果仍呈陽性。對16份臨床鴨血清樣本的檢測限度結(jié)果表明雙抗原夾心法試紙條的靈敏度與中和試驗(yàn)相當(dāng)甚至高于中和試驗(yàn)，間接法試紙條敏感性與中和試